貴港報春苣苔的葉片組培與植株再生

閆海霞 黃昌艷 張自斌 崔學強 鄧杰玲 關世凱 卜朝陽

摘 ?要??以貴港報春苣苔的葉片為外植體，研究不同培養基對其不定芽誘導和增殖、愈傷組織誘導與分化以及生根的影響。結果表明，外植體葉片以縱切為宜，不定芽誘導最適培養基為MS+6-BA?4.0 mg/L+IAA?1.5 mg/L，愈傷組織誘導最適培養基為MS+6-BA?3.0～5.0?mg/L+2，4-D?0.5～1.0?mg/L，不定芽誘導率以及愈傷組織誘導率均為100.00%;愈傷在MS+KT?1.0 mg/L+NAA?0.2 mg/L+potato 30 g/L+banana?30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L培養基上分化系數達12.64;不定芽在MS+ZT?1.0 mg/L+NAA?0.10 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L培養基的增殖系數為8.55;不定芽在3/4?MS+NAA?0.01～0.05 mg/L+活性炭1.0～3.0 g/L培養基上的生根率為100.00%。綜上所述，葉片縱切后能通過不定芽途徑以及愈傷組織途徑建立貴港報春苣苔的組織培養技術體系，在該體系下不定芽增殖系數高、愈傷分化高，組培苗生根好。

關鍵詞 ?貴港報春苣苔;組織培養;再生體系;天然提取物中圖分類號??S68??????文獻標識碼??A

Tissue?Culture and?Plant?Regeneration of?Leaves?of?Primulina guigangensis

YAN Haixia，?HUANG Changyan，?ZHANG?Zibin，?CUI?Xueqiang， DENG?Jieling，?GUAN Shikai，?BU Zhaoyang^*

Flower Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi?530007， China

Abstract ?The effects of different media on the primary induction， adventitious buds proliferation， callus differentiation and rooting culture were investigated?using the leaves of?P. guigangensisas?the explants. The results showed that the rip cutting was the suitable method; the suitable medium for adventitious buds regeneration was MS+6-BA?4.0 mg/L+IAA?1.5 mg/L; the suitable medium for callus induction was MS+6-BA?3.0–5.0 mg/L+2，4-D?0.5–1.5 mg/L; both rate of adventitious buds induction and rate of callus induction were 100.00%; the suitable medium for callus differentiation was MS+KT?1.0 mg/L+NAA?0.2 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L， and the differentiation coefficient?was 12.64; the suitable medium for adventitious buds proliferation?was MS+ZT?1.0 mg/L+NAA?0.10 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L， and the multiplication coefficient?was 8.55; the suitable medium for rooting culture was 3/4?MS+NAA?0.01–0.05 mg/L+active carbon 1.0–3.0 g/L and the rooting rate was 100%.?It was concluded that?the leaves rip cutting could be used to establish?the?tissue culture system ofP. guigangensisby the regeneration?methods of adventitious buds and callus which had high induction and proliferation rates of adventitious buds and good rooting growth.

Keywords ?Primulina guigangensis;?tissue culture; regeneration system; natural extracts

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.015

貴港報春苣苔（Primulina guigangensis）為苦苣苔科報春苣苔屬的多年生草本植物。該種于2011年在廣西貴港市樟木鎮海拔約160 m的石灰巖山區首次發現^[1]。其對環境的要求較苛刻，生態位極為狹小，種群數量正在逐漸減少，因此開展物種保護的研究十分必要，對其進行人工繁殖研究獲得種苗能用于遷地保護和自然回歸。貴港報春苣苔可用種子播種和葉片扦插繁殖2種方式，種子繁殖常受種源及發芽率的影響，葉片扦插繁殖所需時間長，繁殖系數小，而組培快繁具有周期短、易成規模、繁殖后代品質優良的優點，是人工繁殖的有效途徑之一。該技術目前在報春苣苔屬的其他植物上已有相關報道，且逐年增多^[2-12]。但貴港報春苣苔的組培快繁技術未見相關報道。因此，建立貴港報春苣苔的組培快繁體系，對進一步保護和利用該物種具有十分重要的意義。

報春苣苔屬植物多數沒有分枝，也沒有明顯的地上莖，貴港報春苣苔也具有該屬的這一典型特征;此外，花朵、種子等器官又都受季節條件的限制，尤其種子極細小，采收煩瑣，而葉片取材容易，對母株的傷害極小，是理想的外植體類型。故本研究以貴港報春苣苔的葉片為外植體，對初代培養、增殖培養、生根培養的適宜培養基以及移栽關鍵技術進行探討，以期建立離體快繁體系，為其今后的遺傳轉化以及報春苣苔屬的野生花卉資源的保護和利用研究提供理論基礎。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?植物材料??貴港報春苣苔于2015年12月引種，并在廣西壯族自治區農業科學院花卉研究所觀賞植物研發中心人工馴化6個月，生長健壯、無病蟲害（圖1A，圖1B）。實驗于2016年8月—2017年7月開展。

1.1.2 ?培養基及培養條件??基本培養基為MS、1/2 MS、1/4 MS和3/4 MS。MS培養基中的白砂糖為30?g/L，瓊脂為6?g/L，pH 5.4～5.8;1/2 MS培養基的大量元素和白砂糖含量為MS培養基中的1/2，其余成分的含量和MS培養基相同;1/4 MS培養基的大量元素和白砂糖含量為MS培養基中的1/4，其余成分的含量和MS培養基相同;3/4 MS培養基的大量元素和白砂糖含量為MS培養基中的3/4，其余成分的含量和MS培養基相同。

培養基中添加的植物生長調節劑有6-糠氨基嘌呤（激動素，KT）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）。

培養條件：溫度（25±1）?℃，光照強度2000 lx，光照時間12～14 h/d。

1.2方法

1.2.1 ?外植體的處理與初代誘導??取貴港報春苣苔幼嫩葉片，在流水下沖洗10～15?min后，在超凈工作臺上先用棉球蘸取75%酒精拭擦葉片表面，無菌蒸餾水沖洗5次，然后將葉片在75%酒精中浸泡10 s，無菌蒸餾水沖洗5次，再用0.1%升汞（加數滴吐溫-20）浸泡8?min，無菌蒸餾水沖洗5次。將滅菌好的葉片按如下方法切割：橫切（垂直中脈在葉片中間切割，圖1C）、縱切（沿著葉片中脈切割，圖1D），同時切去葉片四周少許組織，保證四周均有傷口。然后將橫切葉片、縱切葉片接入初代培養基中，葉片正面朝上，葉背朝下。培養40 d，觀察葉片誘導情況并記錄，計算誘導率。不定芽以具有1對以上葉片的組培芽計（以下同）。

1.2.2 ?愈傷組織分化??（1）不同植物生長調節劑。在僅附加了KT、NAA這2種植物生長調節劑的培養基中進行分化培養。

（2）不同種類、不同含量天然提取物對愈傷組織分化的影響。在（1）篩選出來的培養基上添加不同種類、不同含量的天然提取物，以此為培養基進行分化培養。

（3）不同天然提取物組合對愈傷組織分化的影響。將（2）篩選出來的培養基進行不同天然提取物的組合，以此為培養基進行分化培養。

本節中的目標培養物均為從葉片誘導出來的愈傷組織，切成1?cm×1?cm大小接入分化培養基中，培養30?d，培養期間每隔3 d觀察培養情況，30?d后統計新產生的不定芽數，計算分化系數。

1.2.3 ?增殖培養??方法參照1.2.2節，目標培養物為具有1對以上葉片的不定芽，培養30?d，培養期間每隔3?d觀察培養情況，30?d后統計新產生的不定芽數，計算增殖系數。

1.2.4 ?生根培養??（1）基本培養基的篩選。選取生長健壯，具有2對以上葉片的植株，轉接于不同的基本培養基中。

（2）附加植物生長調節劑培養基的篩選。在（1）篩選出來的培養基上添加不同植物生長調節劑，以此為培養基進行生根培養。培養40 d后，統計生根數、主根數量、生根時間，計算生根率。

1.2.5 ?移栽??選取具有2對以上葉片、根數較多、

根長適中的組培瓶苗置于溫室大棚中先帶蓋煉苗7?d，然后揭蓋煉苗3?d，取出洗凈基部培養基再進行移栽。基質采用泥炭混合珍珠巖，體積比為2∶1。移栽后置于遮陰通風處，保持基質濕潤。移栽組培苗100株，20 d后統計移栽成活率。

1.2.6 ?測定指標的計算??不定芽誘導率=產生不定芽的葉片數/接種葉片數×100%;愈傷誘導率=產生愈傷組織的葉片數/接種葉片數×100%;分化系數=新不定芽數/接種愈傷數;增殖系數=新不定芽數/接種不定芽數;生根率=生根數/接種數×?100%。

1.3數據處理

各培養階段的實驗處理材料數為100個，進行3次重復，數據均為3次重復的平均值。采用Excel 2003、SPSS 19.0等軟件對數據進行統計與處理，其中多重比較采用Duncans方法。

2??結果與分析

2.1初代誘導

由表1可知，切割方式相同的各處理之間，IAA處理組的不定芽誘導率顯著高于2，4-D處理組的不定芽誘導率（該值為0），但2，4-D處理組的愈傷誘導率顯著高于IAA處理組的愈傷誘導率（該值為0）。即不論切割方式如何，添加了IAA的培養基可誘導產生不定芽，但不能誘導產生愈傷組織，而添加了2，4-D的培養基則可誘導產生愈傷組織，不能誘導產生不定芽。當培養基附加的植物生長調節劑相同時，縱切的不定芽誘導率以及愈傷誘導率均顯著高于橫切的。此外，處理2的縱切葉片在MS+6-BA?4.0 mg/L+IAA?1.5 mg/L培養基上培養時，獲得的不定芽數顯著高于其他處理，但其誘導時間和其他處理間無顯著差異。由此可知，雖然葉片縱切、橫切均可直接誘導出不定芽（圖1E）和愈傷組織（圖1F）。但在30 d的培養時間內，從愈傷組織并未分化出不定芽。因此，葉片以縱切為宜，不定芽誘導培養基為MS+6-BA 4.0?mg/L+IAA 1.5?mg/L，愈傷組織誘導培養基為MS+6-BA 3.0～5.0 mg/L+2，4-D 0.5～1.5?mg/L，不定芽誘導率以及愈傷組織誘導率均為100.00%。

2.2愈傷組織分化

通過表2的方差分析可得，在培養基上附加KT和NAA，隨著濃度的變化，分化系數有所差異。當KT濃度相同時，隨NAA濃度增加，分化系數先上升后下降;其中KT濃度為0.5和1.0?mg/L時，隨NAA濃度增加，分化系數的上升和下降都有顯著差異;KT濃度為1.5?mg/L時，隨NAA濃度增加，分化系數上升有顯著差異，但下降差異不顯著。當NAA濃度相同時，隨KT濃度的增加，分化系數的變化不同;NAA濃度為0.1 mg/L時，分化系數有上升的趨勢;NAA濃度為0.2、0.3?mg/L時，分化系數呈先上升后下降的趨勢，但前者變化顯著，后者的下降變化無顯著差異。由此表明，附加適宜濃度的植物生長調節劑對愈傷的分化以及生長有利，其中，在培養基MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L上，分化系數最高，獲得的芽多，極少玻璃化，不定芽長勢健壯（圖1G），是適宜的分化培養基。

通過表3可以看出，與對照Y₅相比，添加了天然提取物的分化系數因種類、含量不同而不同。隨著提取物含量的增加，分化系數均呈先上升后下降的趨勢，但不同提取物的分化系數的變化略有差異。當添加土豆或椰汁時，隨著含量增加，分化系數的變化存在顯著差異;在土豆含量為30?g/L、椰汁含量為100?mL/L時，分化系數分別為該附加物的最大值。當添加香蕉時，隨著含量增加，分化系數的變化在下降后差異顯著，含量為30 g/L時的分化系數最高。當添加蘋果時，隨著含量的增加，分化系數的上升存在顯著差異，下降后分化系數的變化無顯著差異，當蘋果含量為20 g/L時，分化系數達到最大值。由此可知，培養基MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2?mg/L上分別添加土豆30?g/L、香蕉30?g/L、蘋果20?g/L、椰汁100?mL/L，有利于愈傷的分化，獲得不定芽多，無玻璃化，不定芽長勢健壯。

通過對表4進行方差分析可知，在植物生長調節劑KT為1.0?mg/L以及NAA為0.2?mg/L的條件下，培養基中添加了天然提取物的分化系數顯著高于未添加提取物的分化系數，并且添加了4種天然提取物的分化系數（12.64）顯著高于添加2或3種提取物的培養基的分化系數，培養基中添加了2種天然提取物的分化系數顯著低于添加了3種的。此外，添加了天然提取物的所有處理，其愈傷組織的分化情況均表現為不定芽多，無玻璃化，不定芽的長勢健壯。因此，適宜的愈傷分化培養基為MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+土豆30 g/L+香蕉30 g/L+蘋果20 g/L+椰汁100 mL/L，分化系數達12.64，植株長勢好，健壯（圖1H）。

2.3不定芽的增殖培養

由表5可知，當ZT（或NAA）濃度相同時，隨著NAA（或ZT）濃度的增加，增殖系數呈現增加后降低的趨勢。其中，當NAA濃度為0.5和1.0?mg/L時，增殖系數隨ZT濃度的增加先顯著增加后顯著降低，而濃度為0.15?mg/L時，增殖系數的變化不顯著;當ZT濃度為0.5和1.5 mg/L時，增殖系數顯著增加，而降低則不顯著，濃度為1.0 mg/L時的增加以及降低的變化都有顯著差異。培養基J₅即MS+ZT 1.0?mg/L+NAA 0.10?mg/L的增殖系數最高，和其他培養基有顯著差異，在此培養基上的芽點多且極少玻璃化，不定芽長勢優，是適宜的基本培養基（圖1I）。

由表6可知，與對照培養基MS+ZT 1.0 mg/L+ NAA 0.10?mg/L相比，附加不同種類和含量的天然提取物，其增殖系數有所增加也有所降低。添加土豆和香蕉，隨著含量的增加，增殖系數呈現先顯著增加后顯著下降的趨勢，30?g/L時的增殖系數最高，芽點多，無玻璃化，不定芽長勢優。添加蘋果和椰汁，隨著含量增加，其增殖系數亦呈先上升后下降的趨勢，其中添加蘋果后的增殖系數升降均顯著，但在下降到一定數值后變化不再顯著，在20 g/L時的增殖系數最大;添加椰汁的增殖系數上升不顯著，在100?mL/L時達最大值，在150?mL/L以后的增殖系數變化不顯著。由此表明，在培養基MS+ZT 1.0?mg/L+NAA?0.10?mg/L上分別添加土豆30 g/L、香蕉30 g/L、蘋果20?g/L、椰汁100?mL/L時，增殖系數均為添加同種提取物時的最大值，是適宜的添加量，有利于增殖。

通過對表7的方差分析可知，附加了提取物的培養基的增殖系數顯著高于對照的增殖系數，并且隨著天然提取物種類數量的增加，增殖系數呈上升趨勢。添加2種的增殖系數顯著低于3種、4種的，添加3種的增殖系數顯著低于4種的，即培養基MS+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+土豆30?g/L+香蕉30?g/L+蘋果20?g/L+椰汁100?mL/L的增殖系數（8.55）顯著高于其他培養基。因此，培養基MS+ZT 1.0?mg/L+NAA 0.10?mg/L+土豆30?g/L+香蕉30 g/L+蘋果20 g/L+椰汁100 mL/L是不定芽增殖的適宜培養基，增殖系數為8.55，芽點多，無玻璃化，不定芽長勢優（圖1J）。

2.4生根培養

由表8可知，MS培養基的生根率、平均根數顯著低于其他3種培養基，1/2 MS、1/4 MS、3/4 MS培養基的生根率無顯著差異，但平均根數差異達顯著水平，其中3/4 MS培養基平均根數顯著高于其他培養基，且其生根時間顯著少于其他培養基。因此，培養基3/4 MS適宜作生根培養的基本培養基，在此培養基上植株生長健壯，葉片濃綠，根系多，根無愈傷組織。

由表9分析可得，培養基的生根率均為100.00%，無顯著差異。但NAA和活性炭的含量不同，平均根數和生根時間也有所不同。當NAA濃度相同時，隨活性炭含量的增加，平均根數先增加后降低。其中NAA濃度大于0.3?mg/L時，平均根數、生根時間無顯著差異;當NAA為0.1 mg/L時，生根時間差異不顯著。由此可得，適宜生根的培養基為3/4 MS+NAA 0.01～0.05 mg/L+活性炭1.0～3.0 g/L，生根率為100.00%，根系發達，植株健壯（圖1K）。

2.5移栽

移栽后的組培苗放在溫度為15～30?℃，空氣濕度為90%以上，光照2000～4000 lx的環境中，并保持基質濕潤。20?d后，成活率可達100.00%（圖1L）。

3??討論

多數報春苣苔屬植物沒有分枝，也沒有明顯的地上莖，而花朵、種子等器官又受季節條件的限制，故莖段、花朵、種子均不適宜作為外植體，而葉片取材容易，對母株的傷害極小，是理想的外植體類型。現有的報春苣苔屬植物的組培快繁研究多以葉片為外植體，但對葉片的處理方式沒有進行深入研究。本研究對葉片進行橫切、縱切后，平鋪插入培養基中，結果得出不同的葉片切割方式對初代誘導的影響不同，縱切的不定芽誘導率以及愈傷誘導率均顯著高于橫切的，縱切獲得的不定芽數量較多。葉片切割方式不同，產生的不定芽數量不同，這一觀點在葉插繁殖中已獲證明。如疏花報春苣苔、百壽報春苣苔和王氏報春苣苔采用全葉插（不切割）、1/2或1/3下段方式扦插獲得的子株少，中上段扦插獲得的子株多^[13]。螞蟥七、牛耳朵和尖萼唇柱苣苔以橫切兩段式葉插，上半部分形成子株最多，而全葉插和兩段式葉插的下半部分形成子株較少^[14]，原因是全葉插和兩段式葉插的下半部分帶葉柄葉片，因只有葉柄能接觸基質，因此形成子株數量較少，而兩段式葉插的上半部不僅能在切斷的主脈處形成子株，在次級較粗側脈亦能形成子株，因此形成子株數量多。但弄崗報春苣苔同樣采用了全葉插和兩段式葉插的扦插方式，卻發現葉片橫切兩段式的上部分獲得的子株較全葉插和兩段式葉插的下半部分子株少^[15]，具體原因還有待于進一步研究。本研究規避了葉片接觸培養基不均的問題，以平鋪的方式接觸培養基。結果表明，縱切的不定芽誘導率以及愈傷誘導率均顯著高于橫切的，縱切獲得不定芽顯著高于橫切的。原因可能是，一方面葉脈部分薄壁細胞多，運輸營養物質的能力強;另一方面不定芽多數是從傷口處發生，而縱切中帶傷口葉脈接觸的培養基面積大，橫切僅有部分帶傷口葉脈接觸培養基。因此，葉片縱切形成的不定芽多^[16]。

天然提取物一般從植物材料中提取，有效成分為氨基酸、酶、植物激素。本研究采用了4種天然提取物：土豆、香蕉、蘋果、椰汁。此類提取物常用于蘭花的組培研究中，如在基本培養基中添加適當的香蕉泥、椰乳可在一定程度上促進蝴蝶蘭原球莖的增殖^[17]，添加10%馬鈴薯汁有利于鐵皮石斛原球莖的增殖和芽的分化^[18]，添加土豆汁對文心蘭的增殖具有促進效果^[19]，添加香蕉汁更有利于原球莖的分化和組培苗生根^[20]。而在苦苣苔科植物的組培中并未見相關報道。本研究采用這4種天然提取物，研究了單一使用以及組合使用對不定芽增殖以及愈傷組織分化的影響，結果得出，單一添加土豆30?g/L、香蕉30?g/L、蘋果20 g/L、椰汁100 mL/L時，增殖系數、分化系數均為添加同種附加物時的最大值;組合添加時，添加4種的分化系數顯著高于添加2、3種的，添加2種附加物的分化系數顯著低于添加了3種附加物的分化系數，這和張超等^[21]的觀點是一致的：將2～3種有機附加物進行組合添加，效果常優于單獨添加，原因可能是不同有機附加物組合的營養成分更為豐富。

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