植物組織培養過程中的DNA甲基化研究進展

石鵬 王永 金龍飛 張大鵬 趙志浩 曹紅星 雷新濤

摘 ?要??組織培養是植物無性繁殖和遺傳轉化的重要技術基礎。組織培養包括外植體脫分化、愈傷組織形成、再分化等過程，最后形成新的植株。在植物組織培養過程中，DNA甲基化模式不斷發生變化，表明植物細胞發生了大量的表觀遺傳重編程事件。一般來說，DNA甲基化可以促進或加快組織培養過程，對于許多很難進行組織培養和再生的植物來說非常重要。本文主要總結了植物組織培養過程中DNA甲基化模式的變化規律和分子機制，以及新的研究手段和思路，旨在為開展植物組織培養過程中的DNA甲基化研究提供幫助。

關鍵詞 ?植物;組織培養;DNA甲基化中圖分類號??Q37??????文獻標識碼??A

Research Progress on DNA Methylation During Plant Tissue Culture

SHI Peng， WANG Yong， JIN?Longfei， ZHANG Dapeng， ZHAO?Zhihao， CAO Hongxing， LEI Xintao^*

Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Key Biological Laboratory of Tropical Oil Crops， Wenchang， Hainan 571339， China

Abstract ?Tissue culture is the important technical basis for plant asexual propagation and genetic transformation. Tissue culture includes explants?dedifferentiation， callus formation， callus redifferentiation and plantlets formation. DNA methylation pattern is constantly changing during tissue culture， which means many epigenetic reprogramming events occur in cells. Generally speaking， DNA methylation can promote or accelerate the tissue culture process， its very important for many plants that are difficult to regenerate. The paper mainly summarizes the pattern change and molecular mechanism of DNA methylation during plant tissue culture， as well as new methods and ideas. We hope the paper could help the study of DNA methylation in plant tissue culture.

Keywords ?plant; tissue culture; DNA methylation

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.029

植物組織培養是非常實用的技術之一，可以生產出基因型高度一致的克隆苗，還是遺傳轉化的重要平臺^[1]。擬南芥、水稻、玉米和毛白楊等植物組織培養技術成熟，發展出了相應的遺傳轉化體系^[2-5]]。然而，油棕和椰子等木本植物的組織培養技術難以成功，其中原因未知^[6-7]。另外，大量研究發現，植物組織培養生產的克隆苗會發生

表型變異^[8-10]。得益于高通量測序技術的發展，木本植物組織培養難和克隆苗產生變異的分子機制正逐步揭示。近年來的研究表明，植物組織培養過程伴隨著大量的表觀遺傳修飾，其中DNA甲基化修飾扮演了重要角色^[11]。DNA甲基化在調控基因的組織特異性表達方面發揮了重要作用，但其在植物組織培養過程中的作用機制還知之甚少。

1??植物組織培養

從20世紀后半葉開始，植物組織培養技術發展迅速。利用組織培養技術，植物外植體可以產生大量高度一致的無性系植株，用于培育新品種，也可據此構建遺傳轉化體系，開展基因功能研究。植物組織培養的理論依據是植物“細胞全能性”。無菌條件下，分別在愈傷誘導、體細胞胚胎發生、生根等培養基上進行培養，就可以誘導出愈傷組織、胚狀體、不定芽和根等器官，最終形成再生植株。植物組織培養主要涉及脫分化和再分化過程，脫分化涉及染色質水平的動態重構，以此來誘導形成愈傷組織。隨后改變培養基中生長調節物，增殖細胞開始再分化，誘導器官發生或形成植株。然而，植物組織培養的時間和難度受物種、外植體類型、培養基成分和環境因素影響，研究表明，DNA甲基化與其存在緊密聯系^[12]。另外，研究人員希望通過植物體細胞無性繁殖生產出與外植體完全一致的個體，然而實際情況并不是這樣，體細胞無性系變異（包括生理生化、生物學特性、染色體數目和結構、DNA分子水平等變異）在植物組織培養過程中非常普遍。在分子水平上，體細胞無性系變異受DNA甲基化等表觀遺傳變異的影響^{[8， 10， 13]}。

2??DNA甲基化

表觀遺傳學是目前研究的熱點之一，其領域主要集中在DNA甲基化、基因組印記、核仁顯性、母本效應、基因沉默、休眠轉座子激活以及RNA編輯等幾個方面^[14]。DNA甲基化是其中重要的形式之一。在植物基因組中，DNA甲基化主要為5甲基胞嘧啶（5mC），但也有少量的N6甲基腺嘌呤（6mA）和7-甲基鳥嘌呤（7mG）存在。植物基因組中DNA甲基化比例為6%～30%。DNA甲基化是一種被廣泛研究的表觀遺傳修飾方式，在調控植物再生過程中的基因表達和染色質構象等方面發揮重要作用^[15]。DNA甲基化通常主要指胞嘧啶的5′C位置的甲基化，主要在基因組序列中的CG、CHG和CHH序列（H指A、C或T）中的胞嘧啶上發生^[16]。一般來說，高度DNA甲基化會抑制基因表達，去甲基化可以激活基因表達。擬南芥基因組3種甲基化水平分別約為24%、6.7%和1.7%^[15]。高度重復序列、啟動子區、編碼區域、基因間隔區是甲基化高發區。擬南芥基因啟動子區域DNA甲基化比例大于5%，編碼區DNA甲基化比例在1/3以上?？傮w情況是，啟動子區甲基化和編碼區DNA甲基化與轉錄水平高度相關。編碼區DNA甲基化程度高，則基因轉錄水平也越高，啟動子區甲基化程度高，轉錄水平則降低。目前研究認為，被子植物中存在至少5類基因甲基化模式：基因未發生甲基化，基因發生甲基化，基因轉錄起始位點甲基化，基因轉錄區域較高的CG和CHG甲基化，以及基因轉錄區域較高的CHH甲基化^[16]。

2.1DNA的從頭甲基化和維持

在高等植物中，DNA胞嘧啶甲基化的狀態由DNA甲基化轉移酶、DNA去甲基化酶、組蛋白修飾酶、核染色質重塑因子以及RNA干擾機制共同維持^[16-19]。在植物中，可能有2種甲基化模式：①從頭甲基化，是指原本未甲基化的DNA雙鏈進行甲基化的過程，通過維持甲基化的酶來保持其穩定狀態;②DNA甲基化的維持，指甲基化模式在細胞分裂過程中復制的過程，通過維持甲基化酶的作用，以半保留復制方式將親本的甲基化模式傳遞給子代。植物的從頭甲基化由域重排甲基化轉移酶DRM2（domains rearranged methyltransferase?2）催化，而甲基化狀態通過3個不同途徑維持：①CG甲基化是植物基因組中最普遍的胞嘧啶甲基化類型，在DNA復制過程中主要由甲基轉移酶MET1（methyltransferase?1）催化和維持;②CHG甲基化主要由染色質甲基化酶CMT3（chromomethylase?3）和染色質甲基化酶CMT2（chromomethylase?2）催化維持;③CHH序列甲基化主要由DRM2和CMT2共同維持。

2.2DNA去甲基化

在植物中，DNA去甲基化依賴4個5-甲基胞嘧啶糖基酶：ROS1（repressor of silencing 1，沉默抑制因子1）、DME（demeter DNA glycosylase，DNA糖基化酶）、DML2（DME-like 2，DNA糖基化酶2）和DML3（DME-like 3，DNA糖基化酶3），通過移除甲基化的堿基并切割DNA骨架來實現，形成的缺口通過DNA聚合酶和連接酶補齊^[18]。ROS1在不同組織中大量表達，阻止轉座子和內源基因的沉默，維持轉座子一定水平的表達，DML2和DML3與ROS1功能類似。DME維持胚乳的基因印記和全基因組DNA去甲基化^[20]。

2.3主要的DNA甲基化基因

2.3.1 ?甲基轉移酶1基因（MET1）??從擬南芥中最先克隆了第1個編碼植物DNA甲基轉移酶的基因MET1，該基因編碼的甲基轉移酶和動物中DNA甲基轉移酶DNMTl同源性很高，主要是維持CG位點的甲基化^[21]。MET1還參與由RNA介導的DNA甲基化過程（RNA-directed DNA methylation，RdDM）。在不存在RNA引物時，RdDM可遺傳的甲基化只發生在對稱位點的胞嘧啶上，并且需要MET1的維持。MET1與DRM共同作用參與RNA介導的CG位點二核苷酸的重新甲基化。

2.3.2 ?染色質甲基化酶基因（CMT）??擬南芥中最先鑒定出染色質域甲基轉移酶，這是植物特有的DNA甲基化酶，結構與哺乳動物的DNMTl相似，主要維持CHG位點的甲基化^[22]此外，CMT還維持其他序列的甲基化。

2.3.3 ?結構域重排甲基轉移酶基因（DRM）??植物中的DRM基因家族與哺乳動物的DNMT3基因家族同源，擬南芥DRM家族有2個成員：DRM1和DRM2，它們的功能是催化植物中非對稱位點的從頭甲基化，主要依靠RdDM完成^[23]。DRM和CMT共同參與非CG位點的甲基化。

2.3.4 ?沉默抑制因子基因（ROS1）??擬南芥ROS1基因編碼有內切酶Ⅲ結構域的核蛋白，其具有對甲基化DNA的糖基化酶和裂解酶的活性^[24]。ROS1作為一種DNA修復蛋白，通過對靶基因啟動子去甲基化抑制基因沉默。

2.3.5 ?Demeter DNA糖基化酶基因（DME）??擬南芥DME基因編碼具有核定位結構域的DNA糖基化酶功能的蛋白質，可以激活來源于母本的2個被甲基化的印記基因的表達^[25-26]。

2.3.6 ?Demeter DNA糖基化酶2/3基因（DML2/3）??擬南芥DML2和DML3是5-甲基化胞嘧啶DNA糖基化酶，在植物器官中廣泛表達^[27]。DML2和DML3不僅可以移除部分胞嘧啶的甲基化，還能維持某些位點的高甲基化水平。

2.4DNA甲基化的主要檢測方法

2.4.1 ?甲基化敏感擴增多態性PCR法??甲基化敏感擴增多態性（methylation?sensitive amplified?polymorphism，MSAP）PCR方法分別使用同裂酶MSPI、HpaII與內切酶EcoR I組合對基因組DNA進行雙酶切，從而得到片段大小不同的DNA片段，然后連上相應的內切酶接頭，根據接頭序列設計相應的引物進行預擴增和選擇性擴增。利用聚丙烯凝膠電泳、毛細管電泳或者其他方法檢測擴增出的差異片段。MSP I和Hpa?II具有相同的識別位點（5′-CCGG-3′），但是對甲基化的敏感程度不同。Hpa?II能識別并切割非甲基化位點與單鏈甲基化位點，不能切割雙鏈甲基化位點，即不能消化含mCCGG、CmCGG、mCmCGG的位點;MSP I能識別并切割非甲基化位點和雙鏈內側胞嘧啶甲基化位點，不能切割單鏈外側胞嘧啶甲基化位點，即不能切割UmCCGG、mCmCGG的位點。因此，PCR可以選擇性擴增出不同的帶型，由此可以判斷基因組甲基化程度。MSAP已經在油菜、油棕和蘋果等植物中得到應用^[28-30]，但是由于其甲基化位點的局限性，不能完全準確反映DNA甲基化水平。

2.4.2 ?酶聯免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）??針對DNA甲基化的酶聯免疫法是對樣品中的5mC進行精確定量，其使用與5mC特異結合的單克隆抗體和帶有發光基團的二抗對甲基化的胞嘧啶進行定量。該方法準確快速，雖然不能獲取序列信息，但是能夠對DNA甲基化水平進行初步的定量分析。駱薇^[31]用ELISA測定轉基因白樺微繁（脫分化和再分化）過程中的DNA甲基化水平，發現其呈現先降低后升高的趨勢。

2.4.3??甲基化DNA免疫沉淀測序法（methylated DNA immunoprecipitation-sequencing，MeDIP-?seq）??免疫沉淀測序法首先要針對5mC設計特異抗體，利用抗體對胞嘧啶甲基化的DNA、甲基結合域（MBD）或其他蛋白質結構域進行免疫共沉淀，然后將這些序列進行高通量測序。該類方法已經應用于玉米、毛白楊和柑橘等植物甲基化區域的分析^{[13， 32-33]}。用MeDIP-seq檢測玉米組織培養過程中全基因組DNA甲基化水平，發現基因上游區域發生大量的甲基化變化事件，并且啟動子區域的去甲基化與該基因位點的表達變化相關。

2.4.4??亞硫酸氫鹽測序法（bisulfite sequencing）??該方法是運用亞硫酸氫鹽處理變性的基因組DNA片段，將其中未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，而已被甲基化的胞嘧啶將不會被轉換。接著通過PCR反應擴增轉變后的序列，將尿嘧啶轉換為胸腺嘧啶，再結合高通量測序技術，未轉化的甲基胞嘧啶最后以胞嘧啶形式被檢測到。該方法可以確定分辨率為單堿基水平的甲基化圖譜，從而被視為辨認基因組DNA甲基化狀態的“黃金標準”。該方法首先應用于擬南芥中，因其高分辨率和豐富的序列信息，目前在油棕和玉米等植物中得到廣泛應用^{[10， 34]}。

3??組織培養過程中的DNA甲基化

3.1變化情況

組織培養過程中DNA甲基化水平持續變化，不同物種、不同時期、基因組不同區域的DNA甲基化水平存在差異。另外，激素和DNA甲基化抑制劑等外源添加物對植物組織培養過程中的DNA甲基化水平也有影響。

愈傷組織形成過程中，DNA甲基化水平變化存在以下4種情況：上升，下降，先降低后升高，先下降后上升再下降。Liu等^[35]通過甲基化DNA免疫沉淀測序、表達譜和小RNA測序，發現脫分化的玉米胚比正常胚甲基化程度高，在胚性愈傷組織誘導過程中，DNA甲基化水平上升。Rival等^[36]使用HPLC（high performance liquid?chrom at ography）分析油棕體細胞胚胎在懸浮培養長期增殖過程中的基因組甲基化水平和體細胞發生能力的變化，發現體外增殖導致DNA甲基化上升，體細胞胚胎發生能力增加。Or?owska等^[37]使用HPLC、SSAP（sequence specific amplified polymor phism，特異序列擴增多態性）和MSTD（methyl-sensitive transposon?display，甲基化敏感轉座子顯示）等方法分析大麥花藥和未成熟胚組織培養過程中的DNA甲基化變化，發現不同外植體之間沒有差異。單株無性系形成過程中甲基化水平提高，轉座子在組織培養過程中被激活。組織培養可能會激活一些轉座子，而有一些則始終保持沉默。Temel等^[38]用甲基化敏感限制性指紋圖譜（methylation-sensitive restriction finger- printing，MSRF）技術研究大麥愈傷組織形成過程中的甲基化水平變化，發現胞嘧啶甲基化水平呈上升趨勢。韓柏明等^[39]用MSAP技術研究草莓組織培養過程DNA甲基化水平變化，發現DNA甲基化水平下降，甲基化模式變異以去甲基化為主。Matthes等^[29]使用AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性）和MSAP標記分析油棕外植體和無性系之間的多態性，發現MSAP標記在樣品之間存在多態性而AFLP沒有，且DNA甲基化水平降低。Kubis等^[40]分析油棕外植體和無性系轉座子，發現序列甲基化水平存在差異。使用限制性酶McrBC分析發現，在組織培養過程中，全基因組的DNA甲基化水平降低，HPLC分析也發現無性系的甲基化水平要低于外植體。Machczyńska等^[41]利用HPLC分析小黑麥組織培養過程中的DNA甲基化變化，發現組織培養導致DNA甲基化水平降低。DNA甲基化水平降低加快了隨后的體細胞胚胎發生。Stelpflug等^[13]使用MeDIP-seq評估玉米愈傷組織、無性系等全基因甲基化水平變化，發現組織培養過程中甲基化水平降低的頻率更高，在基因上游區域，甲基化變化和啟動子DNA甲基化缺失與隨后位點的表達變化有關。分析組織培養過程中和自然發生的差異甲基化區域（differentially methylated regions，DMRs）的重疊區域，發現重疊區域比例高于預期，說明引起體細胞克隆變異的基因組壓力與自然變異類似，并且某些位點對表觀遺傳變化特別敏感。呂曉婷^[30]研究發現，低濃度的5-氮胞苷對蘋果愈傷組織的形成沒有顯著影響，100?μmol/L的5-氮胞苷處理可以使愈傷組織形成時間比對照提前3?d，結果發現愈傷組織形成過程中，DNA甲基化水平先降低后升高。DNA甲基化可以通過改變相關基因的甲基化模式來參與愈傷組織形成的調控。孟海軍^[42]以來源于同一單胚系的愈傷、胚狀體、葉片以及長期繼代的愈傷為材料建立了山金柑MSAP實驗體系。結果表明，DNA甲基化水平在新鮮愈傷組織中最低，繼代和再生過程中都會上升。丁明麗^[43]利用基因芯片、HPLC法和MSAP標記分析小麥成熟胚脫分化過程中的DNA甲基化變化情況，發現DNA甲基化水平在2，4-D誘導下先下降后上升再下降，并發現了一些差異表達基因。

基因組不同區域的DNA甲基化水平變化不一致。Zakrzewski等^[44]分析甜菜葉片和其誘導形成的愈傷組織的全基因組DNA甲基化，發現反轉錄轉座子和基因的CG和CHG位點甲基化水平上升，DNA轉座子CHH位點的甲基化水平下降，說明葉片和愈傷組織在基因組不同區域呈現不同的甲基化水平。

植物組織培養過程中，DNA甲基化形式會發生變化。張劍鋒等^[45]利用RAPD分子標記研究漸滲系的水稻親本——粳稻品種“松前”在組織培養過程中發生的表觀遺傳變異。結果表明，松前在組織培養過程中發生的變異主要為DNA甲基化變異：一類變異是將未甲基化的CCGG位點的外側胞嘧啶半甲基化，此類變異基本上不能傳遞給再生苗;另一類變異是在CCGG位點內側胞嘧啶甲基化的基礎上，發生了外側胞嘧啶的甲基化，大多數的外側胞嘧啶甲基化在再生苗中發生了去甲基化。

組織培養過程中，添加外源物質會導致植物DNA甲基化水平發生變化。Temel等^[46]用MSRF分析大麥愈傷組織在0.5 μmol/L油菜素內酯處理下的DNA甲基化水平，發現與對照組相比有少量變化。劉鵬飛等^[47]利用MSAP分子標記分析GA（赤霉素）對火龍果DNA甲基化的影響，發現火龍果組培苗DNA甲基化對低濃度GA敏感，對高濃度GA敏感性降低。聶麗娟等^[48]使用MSAP分子標記對菊花組織培養繼代過程中的DNA甲基化進行分析，發現組培苗和添加材料之間有DNA甲基化差異，繼代材料與母體之間也有甲基化差異。Ghosh等^[49]使用MSAP標記分析藍莓葉片外植體和愈傷組織DNA甲基化水平，發現存在較大差異。Bardini等^[50]同時采用免疫標記和MSAP標記分析非生物脅迫（卡那霉素處理）對擬南芥葉片愈傷組織形成的DNA甲基化影響，發現全基因組的DNA甲基化水平降低。

3.2分子機制

植物組織培養過程中會發生DNA甲基化變化，并且需要維持一定水平的DNA甲基化。然而，植物組織培養過程中發生的DNA去甲基化也會導致基因轉錄異常，造成組培苗性狀變異。植物再生過程主要受到WUS（WUSCHEL）、LEC（LEAFY COTYLEDON）、BBM（BABY BOOM）和WOX（WUSCHEL RELATED HOMEOBOX）等基因的調控^[51-52]，其中WUS基因受DNA甲基化調控的研究最為深入。

植物組織培養過程伴隨著DNA甲基化水平的變化，愈傷組織和體細胞胚胎發生等與DNA甲基化密切相關。Ho等^[53]使用焦磷酸測序分析甲基化敏感限制性內切酶差異產物，定量PCR分析表明，油棕EgNB3的甲基化狀態與葉片體細胞胚胎發生率有關。Xu等^[33]以柑橘愈傷組織為材料，設置不添加、添加5-氮胞苷和處理恢復組，通過甲基化組、轉錄組和代謝物含量分析，發現DNA甲基化抑制劑5-氮胞苷能通過激活CpCCD1促進類胡蘿卜素的降解，同時造成全基因組的去甲基化效應。Gao等^[54]使用HPLC技術分析甘藍型油菜組織培養過程中的DNA甲基化水平，發現在含有0.1 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 6-BA的培養基上愈傷組織誘導率最高（91.0%），甲基化水平最低。外植體在培養后6、21、30 d的甲基化比例分別為4.33%、8.07%和38.7%，表明激素的作用和愈傷組織分化與甲基化水平有關。Santos等^[55]利用甲基化敏感酶分析5-氮胞苷對蒺藜苜蓿體細胞胚胎發生和DNA甲基化水平的影響，發現100 μmol/L的5-氮胞苷能抑制體細胞胚胎發生，說明體細胞胚胎發生需要維持一定水平的DNA甲基化，否則會喪失再生能力。Vining等^[32]使用MeDIP-seq技術比較節間莖段、脫分化的愈傷組織和再生植株節間的甲基化差異，發現3種組織在56%基因組區域存在甲基化差異。然而，組織之間的基因啟動子甲基化差異較小。45%的差異甲基化基因是短暫的甲基化，其在愈傷組織中被甲基化，在再生植株中又發生去甲基化。表達芯片數據顯示，啟動子和基因區域發生甲基化的基因表達量比未發生甲基化或只有啟動子發生甲基化的基因表達量更低。4種轉座子豐度顯示，再生植株節間組織有最高水平的甲基化。Stroud等^[11]研究發現，水稻再生植株的DNA甲基化水平降低。啟動子去甲基化與蛋白編碼基因的下調表達有關。組織培養階段發生去甲基化。Wang等^[56]使用MSAP分子標記和基因熒光定量分析水稻組織培養形成的愈傷組織和再生苗的DNA甲基化差異，發現了一些差異表達的DNA甲基化基因[如CMT3、DRM2、DDM1（DECREASED DNA METHYLATION 1）、MET1、DME1和DME2等]。Han等^[34]使用亞硫酸鹽測序法分析玉米組織培養過程中的DNA甲基化變化，發現在多個獨立材料中的一些位點同時發生高比例的DNA甲基化變化，說明這些位點是組織培養過程中表觀遺傳變異的靶位點或者熱點。

植物組織培養再生能力受WUS、LEC、BBM和WOX等基因的調控，這些基因又受DNA甲基化調控。WUS的表達是植物體細胞胚胎發生所必需的，其受到DNA甲基化調控，從而進一步調控下游轉錄因子和功能基因，最終調控體細胞胚胎發生^[52]。Su等^[57]研究表明，生長素梯度和PIN1介導的生長素極性運輸對于WUS誘導體細胞胚胎發生是必要的。擬南芥莖的再生需要生長素介導的WUS基因表達的誘導，WUS基因編碼轉錄因子WUSCHEL，其啟動子發生去甲基化。DNA甲基轉移酶CMT3或者MET1的功能缺失引起的去甲基化會誘導WUS表達，加快莖的再生。因此，DNA去甲基化可以促進或加快組織培養過程，這對于許多很難進行組織培養和再生的植物來說非常重要^[18]。DNA甲基化和組蛋白修飾通過調控WUS的表達和生長素信號來調控擬南芥莖的再生^[58]。Mahdavi等^[59]認為，WUS和LEC1基因受到DNA甲基化調控，從而調控體細胞胚胎發生。Shemer等^[60]研究發現，cmt3突變體表現出CHG甲基化的顯著降低，同時在富含細胞分裂素的莖誘導培養基上具有高的再生能力。在野生型中，WUS的啟動子高度甲基化，然而在cmt3中WUS被富含細胞分裂素的莖誘導培養基誘導表達，說明WUS基因啟動子的去甲基化可能是導致其獲得較高再生能力的因素。Liu等^[61]分析擬南芥莖再生過程中MET1表達的上游信號，發現在莖再生過程中MET1表達模式和WUS的啟動存在動態變化。細胞循環調節因子E2FA是直接促進MET1表達的上游因子。細胞分裂素通過增強CYCD3的表達部分提升了MET1的表達量。結果表明，MET1介導的莖再生受到細胞分裂素誘導的細胞循環調控。DNA甲基化抑制劑5-氮胞苷通過降低DNA甲基化水平，以及LEC1和BBM1的表達強烈抑制體細胞胚胎發生。DNA甲基化和組蛋白修飾共同調控咖啡體細胞胚胎發生，LEC1和BBM1在體細胞胚胎誘導階段表達，而WOX4在胚胎成熟時期表達量降低^[62]。

Ongabdullah等^[10]利用表觀基因組關聯分析鑒定到油棕MANTLED基因，mantled變異使油棕組培后產生果實畸形，影響產量。結果表明，mantled變異是由于油棕EgDEF1基因內含子中的LINE反轉錄轉座子Karma的DNA甲基化水平降低，導致轉錄的可變剪接和提前終止，從而造成果實畸形。

4??研究趨勢和新思路

近年來，結合DNA甲基化組和轉錄組等組學研究植物響應外界刺激的DNA甲基化機制成為趨勢，為研究植物組織培養過程中的表觀遺傳機制提供了思路。Zakrzewski等^[44]利用亞硫酸氫鹽測序法測定甜菜葉片和誘導形成的愈傷組織的DNA甲基化水平，發現在愈傷組織形成過程中，反轉錄轉座子和基因的CG和CHG類甲基化水平降低，而轉座子的CHH類甲基化水平上升。Xu等^[33]結合轉錄組和DNA甲基化組測序，分析發現5-氮胞苷處理后柑橘愈傷組織的類胡蘿卜素降解、ABA含量上升，是由于某些轉錄因子被激活，從而促進了CpCCD1基因的表達。Liu等^[35]利用MeDIP-seq和表達譜分析玉米未成熟胚和愈傷組織的甲基化和基因表達水平，發現甲基化水平上升，而功能基因表達量下降。Yaish等^[63]通過全基因組亞硫酸氫鹽測序法分析蒺藜苜蓿根響應鹽處理（NaCl）的DNA甲基化變化，對差異甲基化基因篩選后進行表達分析，發現鉀離子通道蛋白KAT3基因和ERF類轉錄因子是潛在的鹽響應基因。Feng等^[64]結合全基因組DNA甲基化測序和轉錄組分析研究水稻響應鎘的分子機制，發現差異甲基化和表達的基因主要涉及抗逆、金屬離子轉運和轉錄因子等基因，并發現5-氮胞苷可以降低DNA甲基化水平，促進水稻幼苗生長和鎘的積累。因此，利用DNA甲基化組和轉錄組（或表達譜）測序技術來研究DNA甲基化機制是可行的。

隨著基因編輯技術的發展，目前已經有結合基因編輯技術來開展靶向去甲基化的報道，為研究植物組織培養過程中相關基因的表觀遺傳修飾提供了有效途徑。Gallego等^[65]開發了擬南芥基因組中特定位點靶向去除DNA甲基化的2個新工具，這些工具具有高特異性和低脫靶效應等優點。利用人源去甲基化酶TET1和人工鋅指蛋白ZF融合蛋白ZF-TET1cd靶向開花基因FWA，可以高效去甲基化，引起FWA基因的上調，并形成可遺傳的晚花表型。ZF-TET1cd也可以靶向轉座子CACTA1的甲基化區域，引起去甲基化，改變基因表達。同時，該研究也開發了基于CRISPR/ dCas9的去甲基化系統SunTag-TET1cd，和ZF- TET1cd類似，SunTag-TET1cd系統可以靶向FWA或CACTA1，引起去甲基化，促進基因表達。這些工具為開發優良性狀的表觀等位基因，為重新激活沉默的基因、轉基因或轉座子提供了新的方法。Ji等^[66]開發了“表觀突變”（epimutage nesis）技術，可以通過對擬南芥基因組的隨機去甲基化快速產生DNA的甲基化變異。該技術通過在擬南芥中表達人類TET酶，產生可遺傳給后代的基因組低甲基化，以此來模擬植物中DNA甲基轉移酶MET1的突變體，將表觀突變技術應用于農業上的重要作物，可導致先前由于DNA甲基化而沉默的等位基因的差異表達，從而揭示隱藏的表型變異。因此，未來可以借鑒靶向去DNA甲基化的思路，對組織培養過程中的重要轉錄因子或功能基因進行靶向表觀修飾，加快組織培養進程，提高組織培養效率。

5??展望

目前，植物組織培養過程中的DNA甲基化研究主要在擬南芥、水稻、玉米和柑橘等模式植物和重要農作物中開展，研究層面主要包括DNA甲基化水平變化規律、愈傷組織誘導和體細胞胚胎發生過程中的DNA甲基化分子機制。雖然許多植物的組織培養技術已經非常成熟，但組培再生的分子機制特別是受DNA甲基化調控的機制還知之甚少。另外，許多木本植物，特別是油棕和椰子等棕櫚科植物組織培養過程長，效率低，組織培養困難。因此未來的研究方向，一是借鑒其他植物中添加DNA甲基化抑制劑來促進組織培養的經驗;二是在模式植物中繼續開展組織培養過程的DNA甲基化調控機制研究，理解愈傷組織誘導和體細胞胚胎發生等重要過程中受什么基因控制，這些基因受DNA甲基化調控的機制是什么;三是結合基因編輯技術在模式植物和重要農作物中開展靶向DNA甲基化修飾，定點調控啟動組培再生的關鍵基因表達，加快組織培養進程，提高組織再生效率。

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