鐵蘭液體振蕩培養再生與快速繁殖

李志英 符運柳 徐立

摘 ?要??以鐵蘭葉片為外植體，誘導獲得脆性愈傷組織，液體振蕩進行胚性愈傷組織培養及快速增殖，固體培養誘導胚狀體萌發、不定芽生根，最后移栽成活，實現了鐵蘭的快速繁殖。在優化的培養條件下，鐵蘭無菌苗葉片愈傷組織誘導率90%以上，振蕩后的愈傷組織100%成為胚狀體，體積增殖系數可達5.0;90%以上的胚狀體可分化為不定芽，95%以上的不定芽可誘導生根，移栽成活率95%以上。研究結果表明成功進行了鐵蘭的液體振蕩培養及快速繁殖。

關鍵詞 ?鐵蘭;胚性愈傷組織;液體振蕩培養;快速繁殖中圖分類號??Q949.718.16??????文獻標識碼??A

Rapid Propagation of Tillandsia cyanea?‘Bert Through Liquid Shake Culture

LI?Zhiying^{1，2，3}， FU?Yunliu^{1，2，3}， XU?Li^{1，2，3*}

1.?Institute of Tropical Crop Genetic Resources， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hannan?571737， China;?2.?Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture?and Rural Affairs， Danzhou， Hainan?571737， China;?3.?Hainan Provincial?Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation， Danzhou， Hainan?571737， China

Abstract ?Using the leaf ofTillandsia cyaneaas the explants， the fragile callus was induced. The rapid multiplication of embryonic callus was realized through liquid shake culture. In solid medium， the germination of the embryos and rooting of adventitious shoots were induced respectively. Rooting plantlets were transplanted and survived with high rates. In the optimized culture condition， the induction rate of callus was more than 90%. All the embryonic callus turned into embryos after liquid culture and the induction rate of the explants volume reached 5.0. More than 90% embryos developed into adventitious buds and 95% of the buds rooted after culture in solid medium. The transplanting survival rate was also more than 95%. These results indicated that the liquid oscillation and rapid propagation ofT. cyanea was successful.

Keywords ?Tillandsia cyanea ‘Bert; embryonic callus; liquid shake?culture; rapid propagation

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.014

鐵蘭（Tillandsia cyanea‘Bert）又稱扇鳳梨，屬于鳳梨科（Bromeliaceae）鐵蘭屬，是多年生單子葉植物，鳳梨科植物數據庫中記載鐵蘭屬有704個原生種，經過培育用于觀賞的栽培種有60多個。鐵蘭莖短，植株比較矮小，扇形總苞片可觀賞數月，為迷你型觀賞性植物，具有很強的凈化空氣的能力，適于盆栽裝飾室內，擺放于陽臺、窗臺、書桌等，也可懸掛在客廳、茶室，還可做插花陪襯材料。

鐵蘭通常用分株法繁殖，即在開花后萌發的吸芽發育到一定大小時，從母株分離栽種，獲得新的植株^[1]。這種方法繁育種苗周期長，繁殖系數低，不宜作為鐵蘭種苗批量繁育的方法。利用組織培養技術繁育鐵蘭種苗是目前較為常用的方法，可通過不定芽增殖途徑獲得批量種苗^[2]，也可通過體細胞胚的誘導獲得再生植株^[3]。但已經報道的組織培養技術，均采用固體培養基，周期相對較長，從取材到批量出苗需要2～3?a時間，繁育過程中需要投入相對較多的人力和物力進行多次批量繼代。

液體振蕩培養技術周期短，速度快，多用于蘭科植物的快速繁育^[4-6]，亦有其他植物的少量報道^[7]，但鮮見于鳳梨科植物的組織培養。本研究以鳳梨科植物鐵蘭為材料，在前期固體培養的基礎上，改良了愈傷組織的誘導技術，探索了其液體振蕩培養技術，以期為鳳梨科植物種苗的快速繁育及品種培育提供參考。

1??材料與方法

1.1材料

以本實驗室離體保存的鐵蘭無菌試管苗為實驗材料^[2]。

1.2方法

1.2.1 ?愈傷組織的誘導??以鐵蘭無菌苗的葉片為外植體，切掉葉尖及基部葉鞘后，再切成0.5?cm長的段，接種于添加不同濃度6-BA及NAA的MS固體培養基上，每皿10塊，每個處理10皿。

1.2.2 ?液體振蕩??將葉片誘導形成的易碎的愈傷組織，取0.5?cm見方的團塊，輕輕壓碎，接種到液體培養基Ⅰ，即添加0.1～0.5?mg/L?2，4-D的MS液體培養基，50 mL的三角瓶，首次加培養基10?mL，逐代增加，每7?d繼代1次。連續3次后，接種到液體培養基Ⅱ，即添加0.1～0.3 mg/L?2，4-D和0.01～0.05 mg/L?KT的MS液體培養基，用150?mL三角瓶，50?mL培養基，增殖后改用250?mL三角瓶，100?mL培養基，每14?d繼代1次，每個處理3瓶。

1.2.3 ?胚狀體萌發??將經過繼代培養得到的胚狀體，接種到添加1.0?mg/L?6-BA及0.01?mg/L NAA的MS固體培養基上培養90?d，誘導胚狀體萌發不定芽。每瓶接種5個胚團，每個處理10瓶?；蛎科拷臃N0.5?mL 胚懸浮液，每個處理3瓶，解剖鏡下觀察萌發情況。

1.2.4 ?不定芽生根誘導??待不定芽伸長到2～3?cm時，將不定芽叢進行單株分離，接種到不同的生根培養基，1/2?MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L，培養40 d。每瓶接種5個芽，每個處理10瓶。

1.2.5 ?移栽??將生根苗連瓶放置在控溫大棚中煉苗，一周后將苗移出培養瓶外，洗凈小苗根部的培養基，進行移栽。取草炭土、椰糠和河沙，按體積比計為草炭土∶椰糠∶河沙=4∶3∶1的比例配成基質，提前澆透水，并覆蓋薄膜保濕。

將已經濕透的基質進行淺翻，然后耙平，并用竹棒打孔，孔深1～2?cm，將小苗根部輕輕放到孔中，并用周圍的基質填充，稍壓實，用噴霧的方法淋定根水。移栽后，覆蓋薄膜保濕，空氣濕度保持95%～100%，基質濕度保持80%～90%，7～10?d后逐漸降低到70%;遮陰度60%～70%，7～10?d后逐漸減少到30%。溫度25～32?℃。

1.2.6 ?培養條件??固體培養基添加蔗糖濃度為30?g/L，卡拉膠濃度6?g/L;液體培養基添加蔗糖30?g/L，均于滅菌前調pH為5.80。固體培養光照強度15～20??mol/（m²·s），溫度（26±1）?℃，光照時間8 h/d。液體培養為黑暗條件，溫度（25±0.5）?℃，轉數90 r/min。

1.2.7 ?懸浮物體積的測量??將懸浮物搖勻后，利用一次性15?mL無菌移液管，剪掉細頭，吸取5?mL，靜置5?min，觀察培養物的體積，并計算每瓶培養物的體積。連續測量4代，根據每瓶對應的體積及體積差，計算平均增殖系數。每個處理2瓶。

1.3數據處理

采用鄧肯氏新復極差法進行實驗數據的分析與比較。

2??結果與分析

2.1愈傷組織誘導及增殖

鐵蘭無菌苗葉片切段后，接種到愈傷組織誘導培養基培養40～50 d，葉片基部分化出易碎的愈傷組織（圖1A），愈傷組織誘導率達90%以上（表1）;將愈傷組織與葉片分離后，接種到新鮮的培養基上繼續培養，可進行增殖，從而獲得較多的易碎的胚性愈傷組織（圖1 B）。

2.2胚性愈傷組織液體振蕩

將疏松易碎的胚性愈傷組織塊輕輕壓碎，接種到繼代培養基Ⅰ中進行黑暗振蕩培養3代后，愈傷組織顏色變淺，分散成黃白色的顆粒（圖1C）。將在培養基Ⅰ中獲得的培養物用培養基Ⅱ繼續培養，培養物快速增殖，每個周期的增殖系數最高為5.0（以體積計算）（表2）。多數培養物發育為較大的胚團塊（圖1D），少量細小，為單個橢圓形胚（圖1E），成胚率為100%。

2，4-D濃度對胚性愈傷組織發育具有較為明顯的影響。2，4-D濃度為0.1～0.3?mg/L時，形成的胚為橢圓形，白色至淺黃色（圖1C）;當2，4-D濃度提高到0.5?mg/L時，胚顏色為黃色，形狀不規則，畸形胚增多（圖1F）。KT的濃度對培養物的增殖具有影響，隨著KT濃度的提高，增殖系數增加。但在2，4-D濃度較低時，存在少量非胚性愈傷組織。當KT濃度繼續提高，多次繼代會導致液體振蕩培養過程中部分胚狀體發育為不定芽，導致生長不整齊（數據未列）。

因此，根據本研究的結果，以2，4-D 0.3?mg/L和KT 0.05?mg/L的組合最好，胚狀體狀態良好，增殖系數高。

2.3胚狀體的萌發

將液體培養所得的胚性愈傷組織轉接到胚狀體萌發培養基，培養60?d，單個胚萌發形成不帶根的芽（圖1G），萌發率90%以上;大的團塊變綠（圖1H）后萌發出叢生芽，單個團塊萌芽數都在30個以上（圖1I），MS+6-BA?1.0/2.0 mg/L+NAA?0.01?mg/L團塊萌發率均可達100%（表3），但6-BA增加，會使部分葉片邊緣及表面分化愈傷組織，不利于后期芽的發育。因此，根據本研究結果，胚狀體的萌發最佳培養基為MS+6-BA?1.0?mg/L+?NAA?0.01 mg/L。

與已有的報道相似，鐵蘭胚狀體萌發形成無根不定芽^[3]，需要進一步誘導生根。

2.4壯苗及生根

胚團萌發形成的叢芽數量太多，需要切分為小叢（圖1J），在胚狀體萌發培養基繼續培養60?d左右，不定芽發育為4～5?cm的壯芽。分離單芽接種到生根培養基，培養30?d左右，可誘導形成1?cm左右的棕色根，每個芽生根2～5條（圖1K），生根率95%以上（表4）。綜合生根率及生根質量，1/2?MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培養基最適于鐵蘭不定芽生根。

2.5移栽

無菌生根苗在大棚中煉苗后洗凈培養基，定植到事先準備的基質上，遮陰保濕管理，移栽成活率95%以上（圖1L）。

3??討論

鳳梨科植物種類繁多，形態和生物學特性差別明顯，而且多數鳳梨科植物不能產生種子。為了解決鳳梨科植物的繁育問題，菠蘿最早被用于進行組織培養獲得再生植株^[8-9]，后進一步誘導菠蘿的葉片分化胚性愈傷組織^[10-11]。與菠蘿相比，鐵蘭的葉片革質化程度更大，誘導愈傷組織困難。符運柳等^[3]以鐵蘭無菌苗的短縮莖為外植體，通過添加2，4-D和6-BA誘導出了胚性愈傷組織，并獲得了再生植株。本研究以鐵蘭無菌苗的葉片為外植體，通過添加6-BA和NAA，誘導葉片基部分化出胚性愈傷組織，為鐵蘭的組織培養提供了新的技術參考。

液體振蕩培養技術因其快速高效而被應用于植物的組織培養，可節省大量人力物力。迄今，應用較為廣泛的是懸浮培養蘭科植物的種子^[6]，原球莖^{[4-5，13-15]}， 也有報道利用叢生芽進行懸浮培養^[16]。代容春等^[7]將固體培養基上誘導的愈傷組織在液體中培養12?d，再轉入固體培養基，可較大程度地提高愈傷組織的分化率及芽數，為提高較難分化芽的植物的培養提供了借鑒。雖然鳳梨科植物的組織培養已經研究多年，但尚未見液體懸浮培養的報道。

液體振蕩培養所采用的外植體一般要細碎、分散性良好，增殖潛力大，鑒于此，只有少量種類的作物可以獲得理想的外植體而應用液體振蕩培養技術進行快速繁殖，例如，蘭科植物多數易生成原球莖，可以采用液體培養技術^{[5，13，17]};有報道利用叢生芽液體懸浮培養，但是易受組織褐變的影響，繼代次數有限，只有極少量種類適用^[18]。以上問題的存在及種苗快速繁育的需求，導致需要探索不同類型的外植體以進行其他植物的液體懸浮培養。胚性愈傷組織，分為易碎型胚性愈傷組織和致密型胚性愈傷組織，其中易碎型胚性愈傷組織結構松散，易分離，更適合進行液體懸浮培養。大量的胚性愈傷組織還可為突變育種、基因工程育種及資源的超低溫保存提供理想材料^[19]。

本研究利用鐵蘭葉片誘導胚性愈傷組織，進行了兩段式液體懸浮培養：第一階段，將葉片誘導獲得的愈傷組織在添加了2，4-D的培養基中短周期（7?d）誘導，形成胚;第二階段，將胚在添加2，4-D和KT的培養基中長周期（14 d）誘導，進行胚的增殖，可以進行鐵蘭胚的快速繁育，增殖系數（以體積計）可達5.0以上。每個胚的團塊進行萌發后，可形成30多個不定芽，增殖效率非常高。該結果表明鐵蘭的懸浮培養技術已經建立，為鳳梨科其他植物的懸浮培養奠定了技術基礎。

該研究尚存在一定的不足，即液體懸浮后，胚的萌發比較緩慢，約90?d;胚萌發不能直接形成完整植株，需要進一步誘導生根;不定芽生長緩慢，60?d高度才能達到4～5?cm。后續研究應努力縮短胚的萌發時間，提高芽的生長速度，直接誘導胚形成完整植株。

致謝本研究材料由國家種質資源熱帶作物中期保存庫提供，特此致謝！

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