半巢式RT-Realtime PCR方法檢測(cè)藜草花葉病毒

賀麗娜 李金慶 厲艷

摘要 [目的]根據(jù)藜草花葉病毒（SoMV）全基因組中多聚蛋白質(zhì)基因序列保守區(qū)，分別設(shè)計(jì)2套TaqMAN探針和引物，建立半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)SoMV的新方法。[方法]提取病毒核酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作合成cDNA，依據(jù)設(shè)計(jì)好的2套TaqMAN探針和引物，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR特異性與靈敏度檢測(cè)，并進(jìn)行2套引物探針的擴(kuò)增效率對(duì)比試驗(yàn)。[結(jié)果]方法特異性強(qiáng)，靈敏度高達(dá)0.4 fg/μL植物總RNA，2套引物探針的擴(kuò)增效率試驗(yàn)對(duì)比結(jié)果顯示擴(kuò)增效率幾乎完全一樣。[結(jié)論]該方法適用于藜草花葉病毒的檢疫鑒定。

關(guān)鍵詞藜草花葉病毒;半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR;檢測(cè)

中圖分類號(hào)S412文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）02-0194-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.060

藜草花葉病毒（Sowbane mosaic virus，SoMV），屬于南方菜豆花葉病毒屬（Sobemovirus）成員。該病毒分布在世界近30個(gè)國(guó)家和地區(qū)，主要分布于歐洲及南北美洲國(guó)家及南非、日本、土耳其等國(guó)家或地區(qū)[1-3]，可通過(guò)汁液、昆蟲(chóng)及種子傳播，具有種傳率極高、抗逆性強(qiáng)和極易傳播蔓延的特點(diǎn)[4]。目前該病毒在中國(guó)無(wú)報(bào)道，被我國(guó)列為禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物。藜草花葉病毒可侵染藜科雜草、葡萄、蘋(píng)果、櫻桃、香石竹、菊花等5個(gè)屬的24種植物[4-5]，這些寄主植物在我國(guó)都有大面積的種植，我國(guó)的氣候條件也與世界上該病毒的許多疫區(qū)的氣候條件相似，因此該病毒一旦傳入我國(guó)，可導(dǎo)致嚴(yán)重危害。

為了保障我國(guó)蘋(píng)果、葡萄等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，開(kāi)發(fā)先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，防止藜草花葉病毒傳入我國(guó)具有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)外已建立了SoMV的RT-PCR檢測(cè)方法[6-7]、IC-RT- PCR檢測(cè)方法免疫捕獲抗原[8]、Real-time PCR檢測(cè)方法[1]、反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法[9]，但尚未見(jiàn)采用半巢式-Real time PCR檢測(cè)SoMV的研究報(bào)道。筆者建立了具有更快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)的半巢式-Real time PCR檢測(cè)SoMV的方法，旨在進(jìn)一步豐富藜草花葉病毒的檢疫鑒定技術(shù)。

1材料與方法

1.1供試材料

藜草花葉病毒（SoMV）、番茄黑環(huán)病毒（TBRV）、草莓潛環(huán)斑病毒（SLRSV）、番茄叢矮病毒（TBSV）和桃叢簇花葉病毒（PRMV）由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所提供。

1.2儀器設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光PCR儀ABI 7000（美國(guó)，應(yīng)用生物公司）;PCR擴(kuò)增儀PTC-200（美國(guó)，MJ公司）;純水儀Milli-Q（美國(guó)，Millipore）;高壓滅菌鍋MLS 3020（日本，SANYO）;高速冷凍離心機(jī)5417R（德國(guó)，Eppendorf）;渦旋振蕩器MS1? minishaker（美國(guó)，IKA）;金屬浴ALB 128（美國(guó)，Thermo）;多用電泳系統(tǒng)PROTEAN II（美國(guó)，BIO-RAD）;凝膠成像系統(tǒng)Universal HoodⅡ（美國(guó)，BIO-RAD）;核酸蛋白分析儀Bio Photometer（德國(guó)，eppendorf）。

1.3試劑

植物總RNA提取試劑盒（DP432）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：RR037A）購(gòu)自TaKaRa公司;實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒Platinum購(gòu)自Invitrogen公司等。

1.4TaqMAN探針與引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中藜草花葉病毒全基因組中多聚蛋白質(zhì)基因序列保守區(qū)，分別設(shè)計(jì)2套TaqMAN探針和引物，探針5′端發(fā)光基團(tuán)為FAM，3′端淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA，引物和探針由上海生工合成。

該研究共設(shè)計(jì)了3條引物和1條探針，其中引物包括1條上游引物和2條下游引物，上游引物SoMVF：5′-CCGATGGAACACTTATTCAACAGT-3′。下游引物用SoMVR表示，其中SoMVR1：5′- TGGAGTTGGTGGAGGAAGTACA-3′;SoMVR2：5′-GCCATAAGGCAGCGGACTC-3′。探針SoMVP：5′-FAM-TCGCCGGGTGTTATGAAGTCAGGATC-TAMARA-3′;PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度SoMVF/SoMVR1為78 bp，SoMVF/SoMVR2為97 bp。3條引物及探針組成2套不同的反應(yīng)組合，套1為SoMVF/SoMVR1/SoMVP，套2為SoMVF/SoMVR2/SoMVP。

1.5病毒核酸提取與質(zhì)量控制采用試劑盒提取病毒葉片及健康葉片（CK）中總RNA，操作步驟詳見(jiàn)試劑盒DP432說(shuō)明書(shū)。提取的核酸用核酸蛋白分析儀測(cè)定濃度與純度值，確保核酸質(zhì)量。

1.6cDNA合成

病毒總RNA及水對(duì)照CK采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在PTC-200 普通PCR擴(kuò)增儀上分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄過(guò)程合成cDNA。反應(yīng)體系：5×Primer Script Buffer 2.0 μL，oligo dT Primer（50 μmol/L） 0.5 μL，Primer ScriptRT Enzyme Mix I 0.5 μL，Random 6 mers（100 μmol/L）0.5 μL，總RNA 2.0 μL，加DEPC水至10.0 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.7實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

1.7.1特異性檢測(cè)。

以上述不同病毒的cDNA及2種陰性對(duì)照為模板，在實(shí)時(shí)熒光PCR儀96孔板中進(jìn)行半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)。反應(yīng)體系：2×PCR buffer 12.5 μL，上游引物（15 μmol/L）1.0 μL，下游引物（15 μmol/L）1.0 μL，探針（10 μmol/L）1.0 μL，ROX 0.5 μL， cDNA 2.0 μL，加ddH2O至25.0 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45 cycles。

1.7.2靈敏度檢測(cè)。

將提取的藜草花葉病毒總RNA，用ddH2O從10-1稀釋到10-10及ddH2O共11個(gè)梯度，分別按照“1.6”中的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行cDNA合成，然后進(jìn)行半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度檢測(cè)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同“1.7.1”。

1.7.3擴(kuò)增效率對(duì)比試驗(yàn)。

采用藜草花葉病毒同一cDNA為模板，分別用2套引物-探針進(jìn)行半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，以比較這2套引物探針的擴(kuò)增效率。實(shí)時(shí)熒光PCR操作同“1.7.1”。

2結(jié)果與分析

2.1特異性檢測(cè)結(jié)果

套1（SoMVF/SoMVR1/SoMVP）和套2（SoMVF/SoMVR2/SoMVP）結(jié)果分別見(jiàn)圖1、2。結(jié)果顯示，2套引物探針?lè)謩e只有在SoMV的cDNA為模板的反應(yīng)中出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他4種病毒和2種陰性對(duì)照cDNA均未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，說(shuō)明2套引物探針的特異性很好，符合預(yù)期。

2.2靈敏度檢測(cè)結(jié)果

該試驗(yàn)中所提取RNA濃度與純度值為39.8（約為40）ng/μL，核算蛋白分析儀測(cè)定結(jié)果為OD260/280=2.16，OD260/230=2.33。稀釋后各個(gè)梯度所對(duì)應(yīng)的RNA濃度從4 ng/μL～0.004 fg/μL及ddH2O。反轉(zhuǎn)錄分別合成cDNA后，進(jìn)行半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。套1、套2結(jié)果分別見(jiàn)圖3、圖4。熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果表明，當(dāng)RNA稀釋至10-9（即0.04 fg/μL）時(shí)，檢測(cè)不到信號(hào)，因此該方法檢測(cè)的靈敏度可達(dá)10-8，即0.4 fg/μL植物總RNA。

2.3擴(kuò)增效率對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

套1組合（SoMVF/SoMV R1/SoMV P）和套2組合（SoMVF/SoMVR2/SoMV P）引物探針的擴(kuò)增效率結(jié)果對(duì)比見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，2套引物探針的擴(kuò)增效率幾乎等同。

3結(jié)論與討論

近年來(lái)，隨著國(guó)際貿(mào)易的發(fā)展，進(jìn)口植物種苗批次和貨值急劇增加，進(jìn)口植物種苗口岸呈現(xiàn)集中化與專一化特點(diǎn)，各個(gè)種苗口岸截獲了大量的植物疫情，特別是檢疫性的植物病毒。進(jìn)境種苗中植物病毒的檢測(cè)一直是我國(guó)檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)的重點(diǎn)難點(diǎn)，絕大多數(shù)的口岸局都沒(méi)有掌握植物病毒室內(nèi)的檢測(cè)技術(shù)，很多都還停留在初步判斷階段[10]，如果要鑒定到種，往往需要送到鑒定能力強(qiáng)的省局實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鑒定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。特別是其中木本植物中病毒的檢測(cè)，由于它們?cè)谥仓牦w內(nèi)含量低、分布不均，且時(shí)有復(fù)合侵染等特殊性，傳統(tǒng)的方法，極易出現(xiàn)漏檢和誤檢[11]，藜草花葉病毒就是其中之一。SoMV侵染癥狀常常表現(xiàn)較輕或無(wú)癥狀，且在一些寄主

上， 病毒含量很低，導(dǎo)致生物學(xué)檢測(cè)或血清學(xué)檢測(cè)較為困難[1]。

使用不同的方法，其檢測(cè)靈敏度差異較大[11]。為了確認(rèn)結(jié)果的正確性，經(jīng)常需要對(duì)一個(gè)結(jié)果進(jìn)行另一種方法的確認(rèn)試驗(yàn)，例如通過(guò)RT-PCR方法檢出一種病毒，往往需要通過(guò)ELISA方法進(jìn)行確認(rèn)，但是ELISA方法檢測(cè)靈敏度較低，有可能導(dǎo)致漏檢，這就為結(jié)果的判斷增加了難度，尤其是在檢測(cè)目標(biāo)含量極少的情況下，極易造成結(jié)果判斷錯(cuò)誤。但如果方法之間檢測(cè)靈敏度相近的話，漏檢問(wèn)題就迎刃而解，很少造成漏檢情況。

基于上述原因，筆者建立了半巢式RT-Realtime PCR檢測(cè)藜草花葉病毒的方法。該方法充分利用了實(shí)時(shí)熒光PCR方法所固有的特異性強(qiáng)、可重復(fù)性好、定量分析較準(zhǔn)確、PCR污染少、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)[12]，同時(shí)巧妙地將巢式PCR的原理，運(yùn)用到實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)中[11，13]。設(shè)計(jì)上僅僅在一般實(shí)時(shí)熒光PCR的基礎(chǔ)上增設(shè)了一條引物，就形成了2套完全獨(dú)立的檢測(cè)體系，2套引物探針相互印證，可以減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)，又進(jìn)一步提高了準(zhǔn)確性。這2套引物探針的擴(kuò)增效率極高且近乎等同，這樣就避免了藜草花葉病毒漏檢情況的出現(xiàn)。與單一的巢式PCR或Realtime PCR等方法相比，其檢測(cè)的準(zhǔn)確性、靈敏度更高，同時(shí)也解決了由于靈敏度不同導(dǎo)致結(jié)果漏檢的問(wèn)題。該試驗(yàn)結(jié)果表明，方法檢測(cè)的靈敏度可達(dá)0.4 fg/μL植物總RNA。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2019年

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