UPLC法同時測定霍山黃大茶中兒茶素及咖啡因的含量

胡華萍 孫磊 王艷芬 等

摘要 [目的]建立同時測定霍山黃大茶中5種兒茶素類成分及咖啡因的UPLC定量分析方法。[方法]采用梯度洗脫法同時測定EC、ECG、EGC、EGCG、GC、caffeine，選用Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），流動相為乙腈-甲酸-水梯度洗脫，體積流量為0.2 mL/min，柱溫設為30 ℃，檢測波長210 nm。[結果]測定了霍山黃大茶中兒茶素類和咖啡因的含量，EC、ECG、caffeine、EGC、EGCG和GC分別在相應范圍內線性關系良好（r>0.999 5），平均回收率分別為98.82%、97.30%、96.96%、96.59%、98.89%和100.11%，RSD為1.0%～1.8%。[結論]該方法快速簡捷、靈敏度高、重現性好，可用做霍山黃大茶質量分析方法。

關鍵詞 霍山黃大茶;兒茶素類;咖啡因;UPLC分析

中圖分類號 TS207.3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0202-03

Abstract [Objection]The research aimed to establish an UPLC method for determination of five elected catechins and caffeine in Huoshan Yellow Big Tea.[Method]The extracts of the tea by ultrasonic extraction was analyzed on a Waters BEH C18 column （2.1 mm × 100 mm，1.7 μm） with a mobile phase of acetonitrilewater （containing 0.5% formic acid） for gradient elution at 210 nm，flow rate was set at 0.2 mL/min.[Result]The content of catechins and caffeine in Huoshan Yellow Big Tea was determined.EC，ECG，caffeine，EGC，EGCG and GC had good linear relations in the corresponding range （r>0.999 5），and the average recoveries were 98.82%，97.30%，96.96%，96.59%，98.89%，100.11%，respectively.RSD was 1.0%-1.8%.[Conclusion]The method is quick and simple，has high sensitivity and good reproducibility，and can be used as a quality analysis method of Huoshan Yellow Big Tea.

Key words Huoshan Yellow Big Tea;Catechins;Caffeine;UPLC analysis

茶葉是山茶科植物茶[Camellia.sinensis （L.） O.Ktze]的芽葉，味苦、甘，性微寒[1]。茶葉譽為世界最為流行的健康飲料，烏龍茶、黑茶（普洱茶、茯磚茶等）在抗氧化、肝保護、降血糖等方面表現出較好的生理活性[2-5]。黃大茶屬于輕度發酵茶，是從綠茶發展而來的，在加工過程中需要經過萎凋、殺青、悶黃、提香等工序，最終形成黃大茶特有的色澤油潤，黃葉黃湯，滋味濃厚甜潤，香氣焦香濃郁[7-8]。綠茶味濃，收斂性強，黃茶滋味鮮濃醇爽，究竟是黃茶在悶黃過程中濕熱條件下的高熱反應還是微生物的參與使其生化成分會發生系列變化的緣故值得進一步的研究。該研究以霍山黃大茶（又名皖西黃大茶）為研究對象，利用UPLC色譜方法對其主要活性物質兒茶素類及咖啡因成分進行分析，建立一種快速測定霍山黃大茶中棓兒茶酸（GC）、（-）-表沒食子酸兒茶素（EGC）、咖啡因（caffeine）、表兒茶素（EC）、（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和（-）-表兒茶素沒食子酸酯（ECG）的含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 試材 霍山黃大茶樣品采購于安徽霍山縣亨大茶業有限公司，經安徽農業大學李葉云博士鑒定;對照品EC、ECG、caffeine、EGC、EGCG和GC均來自于武漢天植生物技術有限公司，批號依次為CFN98781、CFN99570、CFN99004、CFN97549、CFN99569、CFN99137，純度大于98%;乙腈（Tidea Co.Ltd），甲酸均為色譜純，超純水自制。

1.2 儀器 Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀（ 美國Waters公司，配備Acquity UPLC QSM、Acquity UPLC Sample Manager FTN、Acquity UPLC PDA Detector 以及Empower 工作站）;FA2004型萬分之一電子分析天平（上海精科天平）;CP225D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯）;Milli-Q 純水機（美國Millipore 公司）;KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）;Fz-02型二兩裝高速中藥粉碎機（溫嶺市百樂粉碎設備廠）。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備。稱取GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG 適量，精密稱定。分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度分別為0.210、0.215、0.216、0.200、0.212和0.201 mg/mL的對照品貯備液。

1.3.2 供試品溶液的制備。黃大茶粉末（50目篩）0.25 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加25 mL 70%甲醇溶液，室溫下浸泡24 h后超聲提取30 min，過濾，濾液加70%甲醇定容于50 mL容量瓶中，精密吸取5 mL濾液加70%甲醇定容至10 mL，0.22 μm濾膜濾過，即得。

1.3.3 色譜條件。色譜柱為waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流動相為乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）梯度洗脫，洗脫程序為0～5 min，8～14% A;5～9 min，14～22.5% A;9～15 min， 22.5% A;15～17 min，22.5～8% A;17～23 min，8% A;體積流量為0.2 mL/min;檢測波長為210 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為2 μL。

1.3.4 線性關系考察。精密吸取“1.3.1”項下GC、ECG、EGC、EC、EGCG和caffeine對照品貯備溶液100、200、400、800、1 000、2 000 μL于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度線，搖勻。依照“1.3.3”色譜條件，記錄色譜圖，測量峰面積并記錄。以對照品質量（X，μg）為橫坐標、峰面積為縱坐標（A）繪制標準曲線，計算6種對照品線性回歸方程。

1.3.5 樣品含量測定。按照“1.3.2”方法制備各批次霍山黃大茶樣品溶液，按照“1.3.3”方法進樣，用外標法計算各物質含量，每個樣品重復3次。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇 試驗中嘗試采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、甲醇-甲酸-水等流動相系統，結果發現使用酸時，GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG分離度及對稱性均良好，保留時間適中。同時發現乙腈-甲酸-水比甲醇-甲酸-水分離度更好，最后確定的流動相條件為乙腈-0.5%甲酸水梯度洗脫，色譜圖見圖1。兒茶素類化合物分子結構中含有多個酚羥基，加入甲酸后能有效的防止拖尾改善峰形。

2.2 標準曲線及線性范圍 GC、ECG、EGC、EC、EGCG、caffeine的保留時間、線性回歸方程、相關系數和線性范圍見表1。結果表明，在相應的濃度范圍內線性關系均良好。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗。

精密稱取霍山黃大茶0.25 g，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，連續進樣 6次，記錄色譜圖，結果表明，GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG的色譜峰峰面積的RSD值分別為0.3%、1.0%、0.8%、0.9%、1.0%、0.8%，說明該儀器精密度好。

2.3.2 穩定性試驗。

稱取霍山黃大茶0.25 g，精密稱定，按“1.3.2”方法制備供試品溶液。分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣1 次，外標法計算得樣品中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量的RSD 分別為0.4%、0.8%、0.5%、0.3%、1.0%、0.9%，表明供試品溶液中6種成分在24 h 內穩定。

2.3.3 重復性試驗。

稱取霍山黃大茶0.25 g，平行6份，精密稱定，分別按“1.3.2”方法制備供試品溶液。按“1.3.3”進樣測定。計算各供試品中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量的RSD值分別為0.8%、1.0%、1.1%、1.0%、0.2%、0.3%，說明該方法重復性良好，符合定量分析的要求。

2.3.4 回收率試驗。

精密稱取已知6種被測成分含量的黃大茶樣品約0.1 g，平行6份，每組分別按黃大茶中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量的100%，加入對照品溶液，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，在“1.3.3”色譜條件下進樣測定，計算回收率及其RSD。結果見表2，各成分的平均回收率為96.59%～100.11%，RSD為1.0%～1.8%，表明這6種化學成分加樣回收率符合定量分析要求。

2.4 樣品含量測定

利用上述建立的方法，對霍山亨大茶葉有限公司2016年生產的6批（S1～S6）霍山黃大茶中兒茶素及咖啡因進行含量測定。從測定并計算的黃大茶藥材中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量（表3）可看出，霍山黃大茶中兒茶素類成分含量最高的為EGCG，這與其他類型茶葉測得的結果相吻合[8-9]。

3 討論與結論

兒茶素類化合物分子結構中含有多個酚羥基，極性較大且顯示一定的酸性，分離存在一定的難度。因此，該研究嘗試在流動相系統中添加一定量的甲酸來改善其分離度，采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、甲醇-甲酸-水等流動相系統，結果發現使用酸時，GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG分離度及對稱性均良好，保留時間適中。同時發現乙腈-甲酸-水比甲醇-甲酸-水分離效果更好，最后最終選擇乙腈-0.5%甲酸-水系統梯度洗脫。兒茶素類化合物在水中的溶解性并不好，溫度和光線均能使發生氧化、聚合，通過單因素試驗，考察提取溶劑、料液比、提取方法及提取時間等因素對所測幾種化學成分的影響，最終確定供試品溶液的提取方法為冷浸24 h后，加70%甲醇，1∶50料液比，超聲提取 30 min。

黃大茶為輕發酵茶，其采摘時間與加工過程有異于其他高端茶葉，其品質與茶樹品質特性、采摘季節和加工工藝密切相關，其產生的生理活性與其內在成分又密切相關。兒茶素類化合物是茶葉的主要化學成分[10]，為天然高效低毒的抗氧化劑，同時在抑菌和神經保護方面表現出較好的活性;咖啡因是一種中樞神經興奮劑，是茶葉中提神醒腦

的主要活性成分。試驗借助超高效液相色譜的高速、靈敏和高分離度的特性，首次建立霍山黃大茶中兒茶素類及咖啡因快速分析方法，為霍山黃大茶的質量控制及后續的研究提供參考。

參考文獻

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