活體采卵技術在荷斯坦奶牛繁殖中的應用

黃啟震 盧文瑾 王麗娟 等

摘要 [目的]為提高優質奶牛的繁殖力，保證低成本的情況下大量生產優質胚胎，對荷斯坦奶牛采用活體采卵的方式采集卵母細胞。[方法]將4頭荷斯坦奶牛分為超排組和非超排組2組，超排組對試驗牛注射FSH，非超排組對對照牛不采取任何處理。對荷斯坦奶牛進行活體采卵，并對卵母細胞數進行統計。[結果]共采集到12枚卵母細胞，經過受精培養后有8枚受精卵發育良好。[結論]采用優化的活體采卵程序并配合超排技術，能夠更好地利用良種奶牛，以達到動物胚胎生產和輔助生殖的目的。

關鍵詞 活體采卵;荷斯坦奶牛;體外受精

中圖分類號 S857.2文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0107-03

Abstract [Objective] ?To improve the ?fecundity of ?highquality breed cattle and produce mass of highquality embryo with low cost， ovum was collected from Holstein dairy cows by using ovum pickup technology. [Method] Four Holstein dairy cows were divided into two groups： superovulation group（A） and nonsuperovulation group（B）. The dairy cows in group A was injected with FSH， no treatment was made on dairy cows in group B. The ovum was collected from Holstein dairy cows by using B ultrasonic instrument and statistics on ?the number of collected ovum was made. [Result] ?12 oocytes were obtained， and 8 fertilized eggs developed well after fertilization culture. [Conclusion] This experiment adopted an optimized ovum pickup procedure combined with superovulation technology， which can make better use of improved dairy cows and achieve the production of animal embryo and assisted reproduction.

Key words Ovum pickup（OPU）;Holstein dairy cows;In vitro fertilization（IVF）

活體采卵技術（OPU），又稱為陰道穿刺采卵（IVR），是 1980年后興起的一種非常實用的實驗技術。近年來我國畜牧業、養殖業以及胚胎技術發展迅猛，所以對優質胚胎的需求量日益增加，市場亟需一種可以推廣的新型技術來填補優質胚胎的空缺，活體采卵技術應運而生。該技術具有非常顯著的優勢，能夠大幅度提高優質奶牛的遺傳力，生產更多的優質胚胎，縮短世代間隔，加快奶牛的育種進程，降低生產成本，尤其是在對未達到生育年齡[1]、超數排卵效果差、老齡[2]或妊娠[3-4]、繁殖障礙[5]的高產母牛進行采卵表現出巨大優勢。與此同時，活體采卵也有很多限制，比如需要更高端的器材設備、采卵操作難度更大，需要技術熟練的實驗操作人員來進行操作。這些因素給活體采卵帶來了一定的影響，盡管如此，活體采卵技術能夠與體外受精、胚胎移植等技術進行配合使用，對奶牛胚胎的生產、發育機理的研究以及輔助生育技術都發揮著非常重要的作用。

活體采卵技術和體外受精、胚胎移植已經成為歐美一些發達國家的重要繁殖技術，并已經應用于商業化生產。OPU 結合分離X、Y精子的性別控制技術，可為大規模工廠化生產體外性控胚胎開辟新途徑。OPU是一個非常先進、重要的繁殖技術，對于加快優質奶牛的繁殖和培育速度，優化牛群結構，推動畜牧業、養殖業等相關產業的快速發展具有重要作用。種源是畜牧業發展的重中之重。當前我國畜牧生產中良種覆蓋率僅35%左右，約85%是從國外引進的。畜禽種業正面臨著國際跨國種業集團種源壟斷和產品進入的雙重壓力。挖掘與利用動物種質資源、揭示繁育機理、創新育種方法、實現高效快繁已成為當前我國畜牧業可持續發展的頭等大事。

1 材料與方法

1.1 供體牛

試驗所用的供體奶牛為4頭3～5歲體型大小相似、健康的荷斯坦奶牛，將其分為超排組（A組）和非超排組（B組）2組：A組，2頭奶牛使用FSH進行處理;B組，2頭奶牛不使用FSH處理。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器。

活體采卵儀（B超儀、手柄、腳踏開關、采卵針、恒溫槽、真空泵、卵泡液收集管）、顯微鏡、PBS液、平皿、紙巾、長臂手套、消毒乙醇、麻醉劑、耦合劑、純水等。

1.2.2 試劑。PBS（Gibco）、肝素鈉、1%胎犢血清、100 μL/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素（Sigma）。

1.3 采卵前準備

采卵前先將設備打開，并將采卵儀器設備連接好，使采卵針的方向調整到正確的出針位置，真空泵調至6.267 kPa，將收集管置于37.5 ℃恒溫槽中。供體牛站立保定，用4 mL 2%鹽酸利多卡因進行硬膜外麻醉，將直腸中糞便全部清除，對外陰部進行清洗和消毒，最后用干凈的紙巾檢驗清洗情況。

1.4 采卵

采用超聲波引導穿過陰道采集卵母細胞。用溫水濕潤探頭手柄，以便減少對牛的損害。右手將B超探頭伸入到母牛陰道穹隆處，左手通過直腸把握住卵巢并將其與B超探頭緊貼，使用B超儀觀察卵巢的輪廓和卵泡。同時，移動卵巢使要穿刺的卵泡位于采卵器的出針位置，用把握探頭的手推動進針管，使針頭刺破陰道壁和卵泡壁，將卵母細胞及卵泡液吸入收集管中。

1.5 卵母細胞的體外成熟（IVM）

培養液為8.63 mL TCM-199+1 mL FBS（Gibco）+20 μL ?FSH、10 μL LH、100 μL E2、肝素25 μL、10 μL EGF、100 μL IGF、10 μL PS。在培養皿中滴100 μL培養液，將 COCs加入到培養液中，然后加入石蠟油正好沒過培養液，在38.5 ℃、95%空氣、5%CO2的培養箱（Thermo Fisher）中成熟22～24 h。

1.6 卵母細胞的體外受精（IVF）

從液氮中取出精液，在空氣中晃動10 s直至精液管上的液氮揮發完畢，放入38.5 ℃的溫水中解凍約30 s。用乙醇棉擦拭管壁，然后減掉一端封口后，將其垂直放入含有2.0 mL洗精液的離心管口處，再減掉另一端封口，加入4.0 mL洗精液，并吹打混勻，放入離心機中1 800 r/min離心3 min。然后，去上清4.0 mL，加入4.0 mL洗精液，1 800 r/min離心3 min;去上清5.8 mL，最后加入600 μL受精液，備用。

將成熟的卵母細胞吸出，放入Hepes液吹打使擴散的顆粒細胞脫落，保留3～5層顆粒細胞。再將其用受精液洗2～3遍，然后放入50 μL受精滴中。吸取50 μL獲能精液加入到受精滴中。在溫度38.5 ℃、含有5% CO2的培養箱中培養16～18 h。

1.7 受精卵的體外培養（IVC）

受精結束后，將受精卵吸入胚胎培養前液中洗2～3遍，將其放入50 μL胚胎培養前液中，在溫度38.5 ℃、含有5%CO2的培養箱中培養48 h，然后吸出25 μL胚胎培養前液，加入25 μL胚胎培養后液，受精后第4天再半量換胚胎培養后液。

2 結果與分析

2.1 卵母細胞計數與分級 由表1可知，試驗共獲得12枚卵母細胞，超排組采集到10枚卵母細胞，非超排組采集到2枚卵母細胞。超排組卵母細胞數顯著大于非超排組。與非超排組相比，超排組的優質卵泡比例顯著低于非超排組。這表明通過超數排卵處理雖然顯著增加了卵母細胞的數量，但對卵母細胞的質量會產生一定的影響。

2.2 受精卵發育狀態觀察

從圖1可以看出，將采集到的卵母細胞分別進行卵母細胞體外成熟、體外受精以及體外培養等，最終得到8枚發育良好的胚胎，其中死亡的4枚胚胎應為Ⅳ級卵母細胞。雖然活體采卵技術可以降低成本，配合超排技術可得到數量可觀的卵母細胞，但在胚胎存活率方面也存在著弊端。總體來看，活體采卵技術在荷斯坦奶牛繁殖中起著不可替代的作用。

3 討論

活體采卵技術優點是能夠將母畜的系譜進行清楚記錄，還可對后備老年奶牛進行卵母細胞的采集，加快畜牧業的發展[6]。提高優質母畜卵母細胞的利用率，對優良母畜以及珍稀動物的遺傳資源有著重要意義。該技術能使超數排卵效果差、老齡高產的奶牛持續提供卵子，并可利用那些有繁殖障礙的牛，使母牛得到充分利用，再結合體外受精和胚胎移植等技術，可以大大提高優質母畜的繁殖潛力，生產更多的優質胚胎，降低優質胚胎的成本[7-8]，為畜牧業的發展提供更多的技術支持。最重要的是，使用活體采卵技術，無需將供體奶牛屠宰，可以重復使用供體牛，大大節約成本，體現動物福利。Bao等[9]研究表明當體內FSH的水平升高時，原始卵泡的數量也會相應增加，縮短原始卵泡在卵巢中停留的時間。顆粒細胞產生FSH受體與FSH有關，當受體數量增加時卵泡顆粒細胞對FSH的應答也越來越明顯，從而促使顆粒細胞的持續發育。

該試驗結果表明，使用FSH激素處理供體牛，可以增加卵巢上的可見卵泡數和卵母細胞數，質量卻沒有減弱。該試驗通過活體采卵技術共采集到12枚卵母細胞，其中8枚在受精后發育良好。Chaubal等[10] 使用FSH處理，每頭平均卵泡數為（16.0±5.0），每次采卵頭均獲可用胚（2.1±1.2）枚。De Roover等[11]使用FSH，每頭平均穿刺卵泡數為（11.9±7.7）枚，平均獲卵母細胞（5.6±4.1）枚，優質卵母細胞率為32%，每頭能獲得可用胚（2.0±2.3）枚。活體采卵可對供體牛進行長期采卵，并能達到良好效果。Merton等[12]研究表明對活體采卵牛采用FSH處理，頻率為每14 d 1次，每次可獲得3.3個可用胚胎。 Goodhand等[13]、江明生等[14]研究也表明，經過FSH處理的母牛在增加卵泡數的同時，還可以提高卵母細胞的數量。佟桂芝等[15]研究表明，每周采集2次獲取的卵母細胞的質量比每周采集1次的卵母細胞的質量高，而采卵頻率與是否使用激素有關，激素處理后每周可采集1次，無激素處理組每周可采集2次，可采卵泡總數無顯著差異。Reichenbach等[16]研究表明用PMSG處理并不能提高供體牛的卵泡數量和卵母細胞數。此結果與很多因素有關，不同的激素及其劑量、個體差異、操作人員的熟練程度和季節因素都會對結果產生巨大差異。該試驗在采卵過程中，由于操作不當導致一頭牛體內出血，這也說明在節約成本提高效率的同時，該試驗技術對奶牛的損害也不容忽視。

總而言之，活體采卵技術能從系譜明確的優質高產奶牛中獲得卵母細胞;活體采卵技術能使年輕、老齡、妊娠、超數排卵效果不理想的奶牛持續供給卵子，大大加快育種的進程;活體采卵技術能夠充分挖掘優質母牛的繁殖潛力，批量生產良種胚胎，降低優質胚胎的生產成本，并能為卵核移植、基因工程、胚胎工程等研究提供必需的材料。OPU 技術在奶牛繁育中有著非常廣闊的應用前景，而更加安全有效的活體采卵方式需要進一步研究。

4 結論

使用優化后的活體采卵技術配合超排技術、IVM、IVF等技術，能降低成本并更好地利用良種奶牛，以達到動物胚胎生產和輔助生殖的目的。

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