植物乳桿菌LPL10的體外益生特性研究

陳瓊 甘祥武 黃魁英 趙樂怡 李學優 鮑志寧

摘要[目的]在篩選到一株食品源植物乳桿菌LPL10的基礎上，通過對其耐酸性、耐膽鹽、抑菌能力和產酸能力進行研究，確定其益生特性。[方法]采用平板活菌計數法測定LPL10的耐酸、耐膽鹽性能，通過抑菌圈法評價菌株的抑菌能力，高效液相色譜法測定LPL10發酵產有機酸能力。[結果]植物乳桿菌LPL10具有良好的低酸耐受能力，在pH 3.5條件下培養24 h活菌數為1.2×108 cfu/mL，存活率為148%;LPL10受0.1%膽鹽抑制影響較小，培養24 h后活菌數為3.60×108 cfu/mL，存活率為356%;植物乳桿菌LPL10對指示菌金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和綠膿桿菌均有良好的抑制作用;LPL10發酵上清液中產的主要有機酸為乳酸和乙酸，相對含量分別為20.33、25.26 mg/L。[結論]體外益生特性研究表明，植物乳桿菌LPL10可以作為潛在的益生性菌株。

關鍵詞植物乳桿菌;耐酸;耐膽鹽;抑菌;產酸能力

中圖分類號TS201.3文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0156-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.047

乳酸菌是發酵糖類且主要產物為乳酸的一類革蘭氏陽性、無芽孢、厭氧生長細菌的總稱，它不僅能夠增強機體免疫力和抵抗力，還能防止部分胃腸道疾病的發生[1-3]。作為一種重要的乳酸菌，植物乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，厭氧或兼性厭氧，該菌與其他乳酸菌的不同之處在于植物乳桿菌的活菌數比較高，能大量產酸，而且產出的酸性物質能夠降解重金屬。植物乳桿菌常見于肉類、奶油及很多蔬菜發酵制品中，能通過胃并定植于腸道發揮益生作用，諸如調節腸道菌群平衡、對致病菌有抑制作用、降低血清膽固醇含量和預防心血管疾病、緩解乳糖不耐癥等。植物乳桿菌及其代謝產物作為微生態調節劑，可抑制人或動物體內常見的致病菌，在食品、飼料等領域受到廣泛關注。要發揮益生作用，益生菌必須能夠耐受人體胃腸道中胃酸和膽汁等不良環境[4-7]。鑒于此，筆者以植物乳桿菌LPL10為研究對象，分別測定其耐酸耐膽鹽、抑菌及產酸特性，以期開發出1株潛在的益生性菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。

植物乳桿菌LPL10來源于農家酸豆角（已通過生化試驗和16S rDNA序列分析方法鑒定）;指示菌金黃色葡萄球菌SAU08、藤黃微球菌MLU02、綠膿桿菌PPY01來源于廣東省微生物種質資源庫。

1.1.2主要試劑及培養基。

膽鹽：廣東環凱微生物科技有限公司;有機酸標準品：Sigma;其他普通試劑均為國產分析純。

LB培養基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH 7.4，配制1 L，固體培養基加入1.2%瓊脂粉。

NA培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，pH 7.2～7.4，配制1 L，固體培養基加入1.2%瓊脂粉。

MRS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏8 g，酵母膏粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸三氨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂200 mg，硫酸錳50 mg，吐溫80 g，pH 6.2±0.2，配制1 L，固體培養基加入1.2%瓊脂粉。

1.1.3主要儀器設備。顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限公司;752N型紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司;生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司;PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司;PCR儀：Bio-Rad公司;高效液相色譜儀：島津LA20液相色譜儀;低溫冷凍離心機：Eppendorf 5427 R。

1.2方法

1.2.1耐酸性能研究。用7 mol/L的鹽酸分別調節MRS培養基pH為2.5、3.0和3.5。將植物乳桿菌LPL10菌種活化后（菌液中菌的活菌數為8.1×107 cfu/mL），以2%的接種量分別接種于pH 2.5、3.0和3.5的MRS培養基，于37 ℃恒溫培養箱中靜置培養，并在0、2、24 h取樣，稀釋至合適梯度后涂布MRS培養基，培養24 h后計算活菌數。對照普通MRS培養基中涂布后的菌落數，計算菌的存活率。公式為存活率=N0/Nt×100%，其中N0表示低pH的活菌數，Nt表示普通MRS的活菌數。

1.2.2耐膽鹽性能研究。將植物乳桿菌LPL10菌種活化后（菌液中菌的活菌數為1.01×108 cfu/mL），以2%的接種量接種于膽鹽濃度分別為0.1%、0.3%和0.5%的MRS培養基中，于37 ℃恒溫培養，并在0、2、24 h取樣，稀釋至合適梯度后涂布MRS培養基，培養24 h后計算活菌數。以普通MRS中涂布后的菌落數為對照，計算菌的存活率。公式為存活率=N0/Nt×100%，其中N0表示膽鹽培養基的活菌數，Nt表示普通MRS的活菌數。

1.2.3抑菌試驗。

1.2.3.1指示菌菌懸液的制備。選取金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌為指示菌，將斜面培養的3種指示菌用4～5 mL生理鹽水洗脫下來，測其OD600并設置OD600=4.00±0.01。

1.2.3.2試驗平板的制備。將3種指示菌培養基加熱融化并冷卻到40～50 ℃，然后按1 μL/mL的比例添加已調配好的指示菌菌懸液，搖勻;用滅過菌的移液管分別移取10 mL已調節好的各培養基到90 mm培養皿中，待其凝固后用滅過菌的打孔器（直徑2.7 mm）打孔;各孔加入5 μL植物乳桿菌發酵上清液，于37 ℃恒溫培養24 h，觀察抑菌效果，并測量抑菌圈直徑[8]。

1.2.4測定產酸能力。將植物乳桿菌LPL10菌種活化后，以2%的接種量接種于MRS培養基中，37 ℃靜置培養48 h，發酵結束后取發酵液4 mL，離心取上清液，采用0.22 um過濾膜進行過濾。液相操作條件為Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm），線性梯度洗脫，進樣量20 uL，示差顯示器檢測，流動相5 mmol/L硫酸，流速為0.6 mL/min，柱溫65 ℃。采用面積外標法進行定量測定。

2結果與分析

2.1耐酸性試驗結果

人體胃酸pH主要維持在2.0～3.0，益生菌通過口服進入腸道需經過胃的酸性環境[8]，因此耐酸性試驗選取3個pH，分別為2.5、3.0和3.5。由圖1和2可以看出，植物乳桿菌LPL10具有一定的耐酸能力。MRS培養基pH為2.5時，LPL10培養2 h活菌數依然保持在9.35×106 cfu/mL水平，但24 h后活菌數明顯降低，生長受到抑制;在培養基pH 3.0條件下，LPL10培養2和24 h后，活菌數都與初始菌數保持在同一數量級上，說明LPL10已能較好的耐受酸的影響，并保持一定的生長率;pH為3.5時，LPL10的生長已不受抑制，培養24 h存活率達到148%，顯示出良好的耐受性。

2.2耐膽鹽試驗結果

耐膽鹽試驗結果顯示（圖3和4），隨著培養基膽鹽濃度越高，LPL10存活率逐漸降低。在0.1%膽鹽濃度下LPL10的生長受膽鹽影響較小，培養2 h活菌數為1.39×108 cfu/mL，培養24 h后活菌數增長至3.60×108 cfu/mL，存活率達356%;在0.3%膽鹽濃度下LPL10的生長已經受到較大的抑制，培養24 h存活率為15.3%，但活菌依然維持在107 cfu/mL水平，LPL10雖受到抑制，但也維持一定的生長率。不同膽鹽濃度下發酵液pH及OD600與活菌數保持一致。

2.3抑菌試驗結果

采用打孔法對植物乳桿菌LPL10的抑菌能力進行測定，抑菌圈直徑越大，表示菌體的抑菌效果越好。試驗結果顯示，LPL10對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌均有一定的抑制作用，其中對綠膿桿菌的抑制效果最明顯，其抑菌圈直徑為6.49 mm。由于植物乳桿菌產酸也具有一定的抑菌效果，還需確定LPL10是否具有產細菌素功能。

2.4產酸特性

產酸是乳酸菌的一個重要益生特性，產何種酸與產酸能力強弱對乳酸菌的應用具有指導作用[9]。該試驗通過高效液相色譜法對LPL10發酵產有機酸能力進行了測定，圖5和6分別是有機酸標準品和LPL10發酵上清液液相圖。對兩者的有機酸出峰時間進行比較，結果顯示LPL10發酵上清液中主要有機酸為乳酸及乙酸，經過計算其濃度分別為20.33、25.26 mg/L（表1）。

3結論與討論

植物乳桿菌是一種被廣泛應用于食品、發酵、青貯等方面的益生菌。隨著研究的深入，近年來植物乳桿菌也逐漸被用作腸道微生態改善制劑用于改善腸道微生態環境，因此對其各種益生能力的要求也逐漸提高。該研究中菌株LPL10為篩選于食品源的野生菌株，已經過生理生化、16S rDNA鑒定確定為植物乳桿菌，并通過體外耐酸耐膽鹽、抑菌、產酸能力試驗，對該株菌的益生特性進行了初步研究。耐酸試驗中植物乳桿菌LPL10顯示出良好的耐酸能力，能夠耐受pH 3.5的酸性環境，但其在低酸環境中的穩定性還不夠突出，后續還有較大的優化空間。在0.1%的膽鹽濃度下，LPL10菌落的存活率達到100%以上。植物乳桿菌LPL10對常見的致病菌均有一定的抑制作用，其中對綠膿桿菌的抑制效果最明顯。液相檢測結果顯示，菌株具有良好的產酸能力。LPL10在體外試驗中顯示出了良好的益生潛力，后續可進一步優化其相應特性。

參考文獻

[1] 王水泉，包艷，董喜梅，等.植物乳桿菌的生理功能及應用[J].中國農業科技導報，2010，12（4）：49-55.

[2] 靳志強，王延樣.植物乳桿菌在人體腸道的益生特性[J].中國乳品工業，2007，35（9）：30-34.

[3] 黃秀敏，張宜靖，李學優，等.植物乳桿菌發酵培養基的優化[J].安徽農業科學，2016，44（24）：6-7，22.

[4]?? LIU Y W，LIONG M T，CHIEH T Y.New perspectives of Lactobacillus plantarum as a probiotic： The gutheartbrain axis[J]. J Microbiol，2018，56（9）：601-613.

[5] 王春光，張雪，李達，等.酸菜來源植物乳桿菌的分離鑒定與耐受性研究[J].食品科技，2010，35（10）：35-38.

[6] 唐雅茹，于上富，國立東，等.一株降膽固醇乳桿菌的篩選及其益生作用的研究[J].食品工業科技，2016，37（1）：142-144，152.

[7] 侯穎，王維宇，牛明福，等.自然發酵泡菜汁中植物乳桿菌的分離鑒定與體外益生特性研究[J].動物營養學報，2017，29（10）：3611-3619.

[8] 甘祥武，黃魁英，曹丁，等.3株植物乳桿菌LPL04、LPL05、LPL14的益生特性[J].食品科技，2017，42（12）：2-5.

[9] 林龍鎮，鄒衛玲，李安章，等.產酸、耐酸乳酸菌的分離鑒定及益生特性[J].華南農業大學學報，2018，39（2）：95-102.