東北地區(qū)雞源多重耐藥大腸桿菌整合子的檢測

馮濤 何紀(jì)元 薛原

摘要[目的]了解東北地區(qū)雞源大腸桿菌耐藥性的流行特征以及整合子-基因盒系統(tǒng)的耐藥機(jī)制。[方法]在檢測耐藥性的基礎(chǔ)上，采用PCR方法對整合酶和整合子進(jìn)行檢測和克隆測序，并且對檢測結(jié)果和耐藥基因盒與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行比對和分析。[結(jié)果]413株分離菌中整合子檢出率為71.91%，整合酶 Ⅰ 和整合酶 Ⅱ 的檢出率分別為65.52%和54.48%，整合酶 Ⅲ未檢出。序列分析得出，共包含6種整合子，各自攜帶不同組合的基因盒。[結(jié)論]Ⅰ 型整合子在細(xì)菌耐藥性的傳播過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

關(guān)鍵詞雞;大腸桿菌;耐藥性;PCR;整合子;基因盒

中圖分類號S852.61文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0083-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.024

雞主要為人類提供食用價(jià)值和藥用價(jià)值，也有一些雞的種類具有觀賞價(jià)值[1]。隨著抗菌藥物使用頻率的逐漸增加，大腸桿菌在臨床上的耐藥情況也越來越強(qiáng)，在近幾年的研究中多重耐藥的情況也較多[2]。耐藥基因的傳播不僅對雞源的飼養(yǎng)有重要影響，而且對人類生活也會產(chǎn)生間接影響。

整合子是一種可以移動(dòng)遺傳的物質(zhì)，具有特異性結(jié)合和捕獲耐藥基因的能力，在整合酶的催化下完成表達(dá)過程[3]。整合子有2種途徑進(jìn)行表達(dá)：一是可以與質(zhì)粒或者染色體連接，二是成為轉(zhuǎn)座子的組成部分，繼而完成其移動(dòng)和表達(dá)的過程[4]。整合子隨質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子的表達(dá)加速了耐藥基因水平以及垂直傳播，耐藥水平和多重耐藥性均有上升。整合子是一個(gè)組合基因，包括兩端高度保守序列和存在于二者之間的可變區(qū)域。在保守序列中含有整合酶基因、決定特異性的序列片段以及可變區(qū)的啟動(dòng)子，整合子可以通過編碼整合酶特異性來選擇結(jié)合特定的基因盒。筆者對東北地區(qū)不同雞源養(yǎng)殖場的大腸桿菌耐藥性和 Ⅰ 型整合子進(jìn)行了檢測，旨在了解雞源大腸桿菌的整合子-基因盒系統(tǒng)的流行情況，為控制雞的多重耐藥性提供依據(jù)和研究方向。

1材料與方法

1.1菌株

大腸桿菌質(zhì)控菌株（菌株編號為ATCC25922），由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;試驗(yàn)用大腸桿菌413株，分離自東北不同地區(qū)雞養(yǎng)殖場。

1.2主要試劑

22種藥敏紙片，包括安普霉素（APR）、氨芐西林（AMP）、環(huán)丙沙星（CIP）、頭孢噻吩（KF）、頭孢他啶（CAZ）、阿米卡星（AK）、氯霉素（C）、阿莫西林/克拉維酸（AMC）、四環(huán)素（TE）、諾氟沙星（NOR）、亞胺培南（IPM）、氟苯尼考（FFC）、氨曲南（ATM）、氧氟沙星（OFX）、復(fù)方新諾明（SXT）、慶大霉素（N）、強(qiáng)力霉素（DO）、多黏菌素B（PB）、卡那霉素（K）、新霉素（NEO）、恩諾沙星（ENR）、阿莫西林（AMX），均由杭州天和微生物試劑有限公司提供;質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA 片段凝膠回收試劑盒均由愛思進(jìn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供;水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（mueller-hinton，MH），由西隴科學(xué)股份有限公司提供;10×Buffer、dNTP、Taq 酶、DL2000 Marker、6×Loading Buffer、pMD18-T 載體、感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α均由TaKaRa公司提供。

1.3藥敏試驗(yàn)

當(dāng)質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)處于CLSI[5]的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)菌株的抑菌結(jié)果有效且穩(wěn)定。試驗(yàn)采用WHO推薦的Kirby-Bauer法[5]對413株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按照抗生素的敏感性擴(kuò)散的抑菌環(huán)直徑來確定不同菌株的耐藥性。然后，采用耐藥、中介、敏感3種評定標(biāo)準(zhǔn)來標(biāo)定抑菌環(huán)的大小，最后進(jìn)行匯總分析。

1.4整合酶基因的檢測

PCR擴(kuò)增體系（25.00 μL）如下：2.50 μL 10×Buffer，2.00 μL dNTP，上、下游引物各1 μL、0.25 μL Taq酶，2.00 μL模板。按照參考文獻(xiàn)[6-8]設(shè)計(jì)引物序列。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5整合子的檢測

參照文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)引物序列。PCR擴(kuò)增體系同“1.4”。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù) 變 性 5 min;94 ℃變性30 s，55.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。對擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6整合子-基因盒的克隆與測序

將整合子的陽性PCR產(chǎn)物擴(kuò)增樣本用膠回收純化后與18-T載體連接，并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中克隆復(fù)制，將質(zhì)粒樣本送至哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測序部進(jìn)行序列測定。將返回的核苷酸序列用DNASTAR軟件分析，與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。

2結(jié)果與分析

2.1大腸桿菌的耐藥性

413株雞源大腸桿菌的耐藥情況表現(xiàn)比較復(fù)雜，結(jié)果見圖1。由圖1可知，對氨芐西林、頭孢噻吩和四環(huán)素3種抗生素的耐藥率都超過80%;對有些藥物的敏感性較強(qiáng)，如多黏菌素B、氨曲南和阿米卡星，雞源大腸桿菌對這些抗生素的敏感性達(dá)70%。

在413株雞源大腸桿菌中，試驗(yàn)菌株中8重耐藥的比例最大，達(dá)7.02%。分離菌株的多重耐藥現(xiàn)象比較明顯，最少為3種，最多為21種，結(jié)果見圖2。

2.2整合酶基因的檢測

413株大腸桿菌中整合酶 Ⅰ 被檢出為陽性的有271株，檢出率為65.52%，見圖3。整合酶 Ⅱ 的陽性菌株有225株，陽性率為54.48%，見圖4。整合酶 Ⅲ基因未檢出。

2.3整合子的檢測

413株雞源大腸桿菌中，Ⅰ 型整合子基因的PCR 產(chǎn)物片段出現(xiàn)多種不同大小的條帶，見圖5。413株大腸桿菌菌株中297株 Ⅰ 型整合子基因擴(kuò)增結(jié)果呈陽性，檢出率為71.91%。

3討論

該試驗(yàn)中雞源大腸桿菌對采用的22種抗生素具有不同程度的耐藥性，多重耐藥可達(dá)21種，其中較高的是8重耐藥，耐8種抗生素的占總數(shù)的7.02%，3重及3重耐藥以上的耐藥菌株包括391株，所占比例可達(dá)94.68%。這些結(jié)果都表明東北地區(qū)雞源養(yǎng)殖場在治療普通疾病時(shí)具有較復(fù)雜的用藥過程，多重耐藥情況明顯，單一抗生素的耐藥性卻并不普遍，大腸桿菌在東北地區(qū)使用的抗生素種類復(fù)雜，在不斷的選擇壓力下逐漸進(jìn)化為多重耐藥的菌株[10]。

該試驗(yàn)使用的PCR引物擴(kuò)增技術(shù)篩選 Ⅰ 型整合子和整合酶，以了解整合子的流行和傳播程度。檢測結(jié)果顯示，雞源大腸桿菌 Ⅰ 型整合子存在具有廣泛性和普遍性，413株大腸桿菌菌株中檢出 Ⅰ 型整合子297株，檢出率達(dá)到71.91%。通過GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫對比分析，發(fā)現(xiàn)雞源大腸桿菌Ⅰ 型整合子攜帶的基因盒組合形式有aadA1-aadA22-aadA23、aadA1-aadA2-dfrA1-dfrA12-drfA15、aadA5-dfrA17、aadA1-aadA2-aadA29-dfrA1-dfrA12-dfrA15、aadA2-aadA28-dfrA12和aadA2-dfrA16。該研究中的整合子中出現(xiàn)的基因盒 dfrA1、dfrA12、dfrA15、dfrA16和dfrA17可以編碼二氫葉酸還原酶; aadA1、 aadA2、aadA5、aadA22、aadA23、aadA28、aadA29能促進(jìn)腺苷轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。李琳等[11]對安徽地區(qū)的雞源大腸桿菌的整合子以及基因盒進(jìn)行了檢測和分析，結(jié)果表明試驗(yàn)的菌種中均檢測出 Ⅰ 型整合子，檢出率高達(dá)100%，其攜帶基因盒的種類主要包括5種，有3種組合形式流行。楊聰?shù)萚12]對寧夏地區(qū)的雞源耐藥性大腸桿菌進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Ⅰ 型整合子的檢出率為75%，其中aadA5-dfrA17基因盒在該研究中也有出現(xiàn)。該研究與國內(nèi)外研究[11-14]報(bào)道的大腸桿菌 Ⅰ 型整合子的檢出率十分相近，主要存在的基因盒包括aadA 和dfrA兩種 ，但基因盒的種類及其組合方式存在較大差異，可能與整合子的地區(qū)分布以及不同地區(qū)的用藥差異有關(guān)。Ⅰ 型整合子在不同地區(qū)不同動(dòng)物源大腸桿菌內(nèi)廣泛存在，尤其是各地區(qū)雞源大腸桿菌的耐藥基因盒流行普遍，證實(shí)了在對雞等禽類的飼養(yǎng)過程中用藥的不合理情況。

該研究對東北地區(qū)（包括黑龍江、吉林、遼寧）的雞源大腸桿菌樣本做了整合子-基因盒檢測試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞源大腸桿菌整合子中 Ⅰ 型整合子的分布比較廣泛。與整合子的關(guān)系密切得主要為aadA和dfrA這2個(gè)基因，這2種基因也是在近幾年國內(nèi)外報(bào)道中整合子介導(dǎo)的最常見的抗藥基因型[15]。 Ⅰ 型整合子對細(xì)菌的耐藥性和多重抗藥率、抗藥譜具有十分重要的作用，是能夠直觀體現(xiàn)多重抗藥性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。雞源大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因是由于臨床治療以及飼料中添加藥物導(dǎo)致，也有可能是由于環(huán)境污染（水源污染、土壤污染）所導(dǎo)致的耐藥性產(chǎn)生。在近幾年的國內(nèi)外研究進(jìn)展中，可以發(fā)現(xiàn)有些耐藥基因盒產(chǎn)生的原因主要是由于傳統(tǒng)的抗生素，而一些新型抗生素的耐藥基因盒在研究過程中很少出現(xiàn)，由此可見這些基因盒的廣泛傳播主要依賴于長時(shí)間的選擇壓力，而新型抗生素還未產(chǎn)生這種影響，但是整合子具有強(qiáng)大的從環(huán)境中獲取基因盒的能力，若不改善用藥情況，可能很快會造成新的耐藥基因盒的出現(xiàn)和廣泛傳播。因此，臨床用藥或在飼料中添加藥物時(shí)，應(yīng)注意多種抗生素輪換使用，不要長期大量使用某種藥物，以減少抗生素的依賴性，避免產(chǎn)生和擴(kuò)散細(xì)菌耐藥性，影響治療效果，造成經(jīng)濟(jì)損失和其他嚴(yán)重后果。

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