云南甘蔗白條病的多基因聯合鑒定

張榮躍 李文鳳 王曉燕 單紅麗 倉曉燕

摘要甘蔗白條病是由白條黃單胞菌Xanthomonas albilineans （Ashby） Dowson引起的甘蔗重要病害。2017年在云南保山、孟定和金平蔗區的甘蔗上發現疑似白條病的病害。從病株蔗莖中分離得到圓形，凸面，光滑，有光澤，黃色的細菌菌落。經柯赫氏法則驗證，分離得到的細菌為該病害的病原菌。使用16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因對分離得到的病原菌進行了分子鑒定，BLAST和系統發育分析表明本研究所獲得的病原菌的3個基因的核苷酸序列與白條黃單胞菌GPE PC73菌株（GenBank登錄號： FP565176）對應基因的核苷酸序列一致性均為100%，在系統發育樹中處于同一分支。根據田間癥狀診斷、柯赫氏法則驗證及分子鑒定結果，確認云南保山、孟定和金平發生的甘蔗病害為X. albilineans引起的甘蔗白條病。

關鍵詞甘蔗白條病;白條黃單胞菌;系統發育分析;云南

中圖分類號：S 432.42

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018178

甘蔗白條病是由白條黃單胞菌Xanthomonas albilineans （Ashby） Dowson引起的甘蔗重要病害之一，其對甘蔗的危害是毀滅性的，常造成巨大的經濟損失[12]。該病害于19世紀20年代在印度尼西亞爪哇島、澳大利亞和斐濟被首次報道，現已廣泛發生于美國、古巴、巴西、澳大利亞、法國、印度和巴基斯坦等40多個植蔗國家和地區[3]。2016年在我國廣西蔗區首次檢測到甘蔗白條病[4]。甘蔗白條病是一種細菌性維管束病害，可通過帶病蔗種進行遠距離傳播，在田間還可通過刀具和收獲工具等機械傳播，也可通過氣流和雨水傳播，且傳播性極強[56]。X. albilineans目前仍是中國進境植物重要的檢疫對象之一[7]。

目前，除云南外，在廣西、廣東、海南、福建均發現了甘蔗白條病[8]。2017年在云南保山、孟定和金平蔗區的甘蔗上發現了疑似白條病的病害。為明確這些病害是否是由X. albilineans引起的甘蔗白條病，本文采用了病害田間癥狀觀察、柯赫氏法則驗證，同時結合16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因序列分析對病原進行了鑒定，旨在為該病害的防控和研究提供參考。

1材料與方法

1.1甘蔗白條病樣品

2017年從云南孟定、保山和金平蔗區采集18份疑似甘蔗白條病樣品，MD1S～MD7S來自孟定，品種為‘柳城031137;BSH1S～BSH5S來自保山，品種為‘桂糖081589;JP1S～JP6S 來自金平，品種為‘ROC1。

1.2病原分離培養及回接試驗

將蔗莖用無菌水清洗干凈，切成5～8 cm，使用75%乙醇溶液表面消毒20 s，然后點火將蔗莖表面乙醇溶液燒盡，連續進行2次。將蔗莖放入滅菌的50 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，吸取離心管底部蔗汁，使用1×PBS緩沖液按10-1～10-8進行梯度稀釋，每個梯度稀釋液吸取50 μL在瓊脂MW培養基進行涂板。瓊脂MW培養基配方參照Davis 等[9]，培養基pH6.8～7.0。配制培養基的所有試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。28℃培養6～8 d后，挑取單菌落進行純化培養。收集純培養的菌體，用蒸餾水配制成1×108 cfu/mL接種懸浮液，對溫室種植的甘蔗進行人工接種，接種方法參照Rott等[10]的方法。以無菌水處理作對照，觀察病害發生發展情況，并對接種后發病的植株進行病原菌再分離。

1.3菌株DNA提取

將純化培養的菌株分別轉接至2 mL MW液體培養基中，于28℃、200 r/min條件下培養7 d，12 000 r/min離心收集菌體，棄上清，使用細菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取DNA。DNA提取步驟參照試劑盒說明書。

1.4多位點基因序列擴增

擴增X. albilineans的16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因的引物參考文獻[11]，引物序列見表1。25 μL擴增反應體系包括ddH2O 10.5 μL、2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL、DNA 模板1.0 μL、上、下游引物各0.5 μL （20 μg/μL）。PCR擴增程序為： 95℃預變性5 min; 94℃變性1 min，55℃退火1 min， 72℃延伸1 min， 25個循環; 72℃延伸10 min。取10 μL擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.5PCR產物克隆、測序及序列分析

使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收PCR產物目的片段，并將其與pEASYT5（北京全式金生物技術有限公司）進行連接轉化，每個轉化挑選6個陽性克隆送華大基因測序。測序結果使用BLAST進行對比。使用DNAMAN V 6.0進行序列一致性分析。運用MEGA V 6.0軟件構建系統進化樹[12]，采用neighborjoining法建樹，模式選擇Kimura 2parameter，自舉檢測（bootstrap）重復1 000 次。

2結果與分析

2.1田間癥狀觀察

2017年在云南保山、孟定和金平蔗區的甘蔗上觀察到疑似白條病的病害。病害癥狀主要表現為葉片上產生白色條紋，沿維管束伸展，有的葉片大面積白化。染病較重的病株蔗莖節間變短，葉片短直，莖的節部長出許多側芽和細小的分蘗，分蘗的葉片上也出現上述的白色條紋 （圖1a）。

2.2柯赫氏法則驗證

從保山、孟定和金平采集的蔗莖樣品中均分離得到圓形，凸面，光滑，有光澤，黃色的細菌菌落 （圖1b）。對分離到的菌株進行回接驗證，接種20 d后，接種甘蔗植株的葉片上出現了白色條紋，新發出的葉片葉尖白化，癥狀與田間發病癥狀相似 （圖1c）。對照甘蔗沒有觀察到任何癥狀。從接種發病的蔗莖中重新分離得到了相同的黃色菌落。經柯赫氏法則驗證，從蔗莖中分離得到的該細菌為甘蔗白條病的病原菌。

2.3病原菌的多基因聯合鑒定

本研究測定了獲得的所有菌株的16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因的部分序列（表2）。結果表明，來自云南孟定、保山和金平的18個菌株的這3個基因的核苷酸序列一致性均為100%，與X. albilineans菌株GPE PC73菌株 （GenBank登錄號： FP565176） 的3個基因的核苷酸序列一致性也均為100%。分別使用這3個基因序列與黃單胞菌屬的其他種構建了系統發育樹 （圖2～4）。在基于16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因構建的3個系統發育樹中，本研究所獲得的菌株與X. albilineans菌株均處于同一分支，明顯區分于黃單胞菌屬的其他種，表明本研究獲得的病原菌與X. albilineans親緣關系最近。

3結論與討論

甘蔗白條病是由X. albilineans引起的甘蔗重要病害。本研究通過對采自云南保山、孟定和金平蔗區的疑似白條病病株進行病原菌分離純化，柯赫氏法則驗證，并結合16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因部分序列對分離得到的菌株進行了分子鑒定，最終確定云南保山、孟定和金平蔗區發生的病害為X.albilineans引起的甘蔗白條病。本研究可為中國今后開展甘蔗白條病的深入研究和科學有效防控奠定基礎和提供參考依據。

甘蔗白條病是一種易隨種苗傳播的危險性病害，對甘蔗生產和發展有潛在的威脅。本研究采集的樣品均來自各蔗區的甘蔗新品種和良種繁育基地，因此，有必要加強對良繁基地擴繁種苗和引進及外調甘蔗的白條黃單胞菌的檢疫和監測，從源頭上控制白條黃單胞菌擴散蔓延，確保甘蔗安全生產和蔗糖產業可持續發展。另外，今后在加強白條病檢疫和監測的同時，應加強甘蔗白條病優良抗源材料和抗病品種的評價篩選，為選育和利用抗病品種有效防控甘蔗白條病提供優良抗源材料。

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（責任編輯：楊明麗）