蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性

劉娟 馮浩 王帥 高小寧 黃麗麗

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摘要為了明確蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性現(xiàn)狀，本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了來(lái)自7個(gè)省份7個(gè)不同年份的106株蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性，并建立了敏感基線。結(jié)果表明：供試蘋果樹(shù)腐爛病菌菌株的EC50區(qū)間在0.003～0.123 μg/mL，敏感性頻率分布呈連續(xù)性單峰曲線。經(jīng)KS法檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，未出現(xiàn)敏感性明顯下降的抗性群體，平均EC50 （0.044±0.029） μg/mL可作為蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感基線。不同地理來(lái)源的菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性有顯著性差異，來(lái)自遼寧省的菌株敏感性最高，河南省的敏感性最低;不同年份的菌株敏感性也有顯著性差異，2009年采集的菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性最高，2016年采集的菌株敏感性最低，菌株對(duì)藥劑的敏感性隨年份的推移逐漸降低，說(shuō)明病菌的抗藥性不斷增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞蘋果黑腐皮殼菌;菌落直徑;苯醚甲環(huán)唑;EC50;抗藥性

中圖分類號(hào)：S 436.611.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018119

蘋果樹(shù)腐爛病（apple Valsa canker）是由蘋果黑腐皮殼屬真菌Valsa mali侵染引起的枝干病害[1]。該病的發(fā)生會(huì)造成樹(shù)皮組織腐爛，樹(shù)勢(shì)削弱，甚至枝枯樹(shù)死，果樹(shù)壽命縮短[2]。因其侵染途徑多樣、潛伏性強(qiáng)、致病機(jī)理復(fù)雜，病害防控困難，治愈率低，被稱為“蘋果的癌癥”[3]。

目前，生產(chǎn)上蘋果樹(shù)腐爛病主要依靠刮除病疤后涂抹藥劑或全樹(shù)噴淋藥劑等措施進(jìn)行防治，所用藥劑種類繁多[45]。化學(xué)藥劑因其操作簡(jiǎn)單，使用方便且見(jiàn)效快而成為防治蘋果樹(shù)腐爛病的主要藥劑。其中甲基硫菌靈可以高效預(yù)防腐爛病菌的侵染[6]，丁香菌酯能有效抑制蘋果樹(shù)腐爛病病疤的復(fù)發(fā)[7]，戊唑醇能有效抑制蘋果樹(shù)腐爛病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)[8]。而三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑雖然尚未在蘋果樹(shù)腐爛病上登記使用，但是其對(duì)腐爛病菌室內(nèi)效果要強(qiáng)于同類殺菌劑戊唑醇[8]，可以作為防治蘋果樹(shù)腐爛病的替代藥劑。

苯醚甲環(huán)唑由先正達(dá)公司于1989年研發(fā)上市，具有高效、廣譜、低毒的特點(diǎn)，對(duì)子囊菌門和擔(dān)子菌門的病菌有很好的防治效果[9]。其作用機(jī)制是抑制真菌細(xì)胞膜上的麥角甾醇合成，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成功能紊亂，從而達(dá)到殺菌的目的[1011]。由于該藥劑作用位點(diǎn)單一，長(zhǎng)期反復(fù)使用會(huì)引起病菌產(chǎn)生抗藥性[12]，被認(rèn)為是一種具有中等抗性風(fēng)險(xiǎn)的殺菌劑。蘋果黑星病菌Venturia inaequalis、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum對(duì)該藥劑已經(jīng)產(chǎn)生了抗性[1314]。近年來(lái)，我國(guó)各地蘋果產(chǎn)業(yè)區(qū)普遍應(yīng)用苯醚甲環(huán)唑等三唑類殺菌劑防治各類真菌病害，是否有抗藥性菌株尚不明確。因此，本研究通過(guò)測(cè)定采自全國(guó)的106株蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性，并比較不同地理來(lái)源、不同年份的菌株敏感性差異，以期明確蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)該藥劑的敏感性現(xiàn)狀，為病害的科學(xué)防治和病菌的抗藥性監(jiān)測(cè)提供重要科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

本實(shí)驗(yàn)室自2007至2016年從陜西、山西和河南等省蘋果產(chǎn)區(qū)的田間發(fā)病植株采集分離了106株蘋果樹(shù)腐爛病菌，其中陜西省54株，山西省18株，新疆維吾爾自治區(qū)10株，河南省11株，遼寧省5株，山東省4株，四川省4株，用于敏感性測(cè)定。

1.1.2供試藥劑與濃度

95.6%苯醚甲環(huán)唑原藥，先正達(dá)公司提供;濃度設(shè)置為0.006 3、0.013、0.025、0.050、0.100和0.200 μg/mL。

1.2方法

1.2.1含藥培養(yǎng)基的制備

將苯醚甲環(huán)唑原藥溶于丙酮制成10 000 μg/mL母液，加入終濃度為0.2%的Tween80，置于4℃冰箱中備用。用蒸餾水稀釋母液，按設(shè)置濃度加入到PDA培養(yǎng)基中，充分混勻，配成不同質(zhì)量濃度的苯醚甲環(huán)唑含藥平板。

1.2.2敏感性測(cè)定

參考Yin等[15]的方法進(jìn)行。被測(cè)菌株于25℃條件下在PDA平板上培養(yǎng)72 h，利用打孔器自菌落邊緣打取大小相同、直徑為5 mm的菌餅，菌絲面朝下接種于含藥平板的中心。每個(gè)濃度重復(fù)3次，以不加藥的PDA平板作為對(duì)照。25℃下培養(yǎng)72 h，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取平均值，計(jì)算不同濃度的苯醚甲環(huán)唑?qū)z的生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%。

以X（藥劑質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值）和Y（抑制率對(duì)應(yīng)的幾率值）進(jìn)行回歸分析得到毒力回歸方程Y=a+bX以及相關(guān)系數(shù)r，并計(jì)算EC50。

1.2.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0進(jìn)行處理。對(duì)EC50進(jìn)行KolmogorovSmirnov正態(tài)性檢驗(yàn)，參照祁之秋等的方法[16]獲得蘋果樹(shù)腐爛病菌群體對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性頻率分布圖，建立對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感基線。采用Duncan氏新復(fù)極差法對(duì)不同地區(qū)、不同年份的平均EC50進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感基線的建立

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，苯醚甲環(huán)唑?qū)?lái)自7個(gè)省的106株蘋果樹(shù)腐爛菌的EC50分布在0.003～0.123 μg/mL，平均值為（0.044±0.029）μg/mL。所檢測(cè)的菌株對(duì)該藥劑具有較高的敏感性，未發(fā)現(xiàn)抗藥性亞群體。但最大值為最小值的41倍，EC50跨度范圍比較大，表明群體內(nèi)個(gè)體間對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性差異較大。

將本研究得到的EC50分成6個(gè)區(qū)間，每個(gè)區(qū)間出現(xiàn)的菌株頻率如圖1所示，EC50敏感性頻率呈現(xiàn)連續(xù)性單峰曲線分布，通過(guò)SPSS中的KS正態(tài)檢驗(yàn)得到P=0.135>0.05，說(shuō)明菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性頻率符合正態(tài)分布，按照野生病原群體對(duì)藥劑的敏感性呈正態(tài)分布的原理，本研究中106株病菌的平均EC50（0.044 μg/mL±0.029 μg/mL）可作為蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感基線。

2.2不同地理來(lái)源的菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性水平

不同地理來(lái)源的蘋果樹(shù)腐爛病菌菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性存在一定的差異（表1），最敏感的是遼寧菌株，其EC50平均值為（0.020 0±0.008 8）μg/mL，最不敏感的是河南菌株，其EC50平均值為（0.059 6±0.023 6）μg/mL。山西、新疆、河南的菌株群體內(nèi)部個(gè)體對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性差異較大。遼寧地區(qū)的菌株同河南、山東和新疆3個(gè)地區(qū)的菌株在P=0.05水平上差異顯著，其他地區(qū)的菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性無(wú)顯著差異。

2.3不同年份的蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性水平

如表2所示，采自不同年份的蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性存在一定差異。2009年采集的菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性最高，2016年菌株的敏感性最低，隨著年份推移病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性逐漸減弱。

3討論

殺菌劑用于防治某種植物病害之前，建立其敏感基線有助于優(yōu)化該殺菌劑的使用策略[17]。雖然苯醚甲環(huán)唑已經(jīng)在生產(chǎn)上應(yīng)用多年，但蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)其敏感性水平尚不明確。本研究共檢測(cè)了采自中國(guó)7個(gè)省份的106株蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性。研究結(jié)果表明中國(guó)蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑還處于野生敏感種群階段，可將苯醚甲環(huán)唑?qū)┰嚲甑腅C50平均值（0.044±0.029）μg/mL作為中國(guó)蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感基線。該敏感基線可用于監(jiān)測(cè)田間蘋果樹(shù)腐爛病菌群體對(duì)苯醚甲環(huán)唑敏感性的變化，為評(píng)價(jià)其抗藥性風(fēng)險(xiǎn)和未來(lái)制定抗藥性治理策略提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn)蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性差異與地理位置有關(guān)，這可能與不同地區(qū)的蘋果種植年限和面積、氣候環(huán)境條件、腐爛病的發(fā)生歷史，用藥措施以及病菌本身的遺傳差異及群體組成等因素有關(guān)[18]。此外，隨著時(shí)間的推移，蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性逐漸減弱，可能是由于生產(chǎn)中連續(xù)大量使用同類殺菌劑或者其他有交互抗性的殺菌劑，使得病菌對(duì)殺菌劑的敏感性發(fā)生了改變。為了延緩蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑抗藥性的產(chǎn)生，建議在田間通過(guò)輪換使用不同作用機(jī)制的藥劑，使蘋果樹(shù)腐爛病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性處于低抗性頻率階段，以延長(zhǎng)農(nóng)藥的使用壽命。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）