肝纖維化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ的表達水平及其臨床意義

黎武 宋勁松

肝纖維化即肝細胞因炎癥或壞死而誘導的肝臟內纖維結締組織異常增生的過程，是肝硬化的重要病理基礎[1-2]。N-乙酰基-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸( N-acetyl-ser-yl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)是一種短肽，是某些致纖維化細胞因子的重要上游激活因子，與肺及其他組織纖維化病理改變存在密切聯系[3]。Smad7是轉化生長因子-β(TGF-β)信號路徑的一種負調節因子，可誘導TGF-β活化，導致肝星狀細胞向成纖維細胞轉化[4]。過氧化酶活化增生受體γ抗體(PPAR- γ)是配體激活核轉錄因子家族成員之一，是炎癥、動脈粥樣硬化等多種病理生理改變的調控因子。本研究觀察肝纖維化患者的Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ的表達水平，并分析其臨床意義。

資料與方法

一、 患者一般資料

選取2017年2月至2018年2月在我院接受治療的肝纖維化患者。納入標準：(1)年齡≥18周歲；(2)經影像學檢查確診為肝纖維化；(3)未合并其他系統疾病；排除標準：(1)相關資料不全者；(2)伴肝癌者。參照前述標準共納入80例患者，其中男55例，女25例，年齡41～82歲，平均(54.85±3.22)歲，肝硬化病程4～15年，平均(8.35±1.47)年；對照組納入標準：(1)年齡≥18周歲；(2)影像學檢測顯示肝囊腫；(3)未合并其他系統疾病，共納入80例，男45例，女35例，年齡45～75歲，平均(56.88±3.27)歲。兩組年齡、性別等一般資料具有可比性。本研究經醫院倫理委員會評審通過，且所有患者均知情同意。

二、方法

對所有患者進行穿刺活檢，將10 mg病理樣本打碎制備為懸液，3 500 r/min，12 cm半徑，離心10 min后，滴入10%血清置于溫箱內進行傳代培養，取部分樣本轉染Smad7，并將其稀釋至96孔板內培養24 h，隨后選取Western blot法檢測Smad7表達水平，相關試劑由上海生工提供，操作參照說明書進行。

將10 mg病理樣本常規切片，并用2%APES處理10 min，枸櫞酸鹽緩沖液修復抗原。同時將PPAR-γ抗體稀釋為1∶100，以PBS為一抗陰性對照，以PPAR-γ為陽性對照，根據美國Santa Cruz公司提供的PPAR-γ試劑盒說明書進行免疫組織化學一步法檢測。

將10 mg病理樣本打碎，滴入2 mL PBS進行勻漿，置于-25 ℃溫箱內過夜，以破壞細胞膜。低溫3 500 r/min離心6 min，取上清，參照上海易匯生物科技有限公司提供的Ac-SDKP ELISA試劑盒進行檢測。同時選用北京普朗(集團)有限公司生產的PUZS-300普朗全自動生化分析儀檢測患者肝功能指標。并選用ELISA法檢測患者TGF-β1、TNF-α和IL-6水平，試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司提供，參照說明書進行操作。

三、評價指標

觀察兩組患者肝組織Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ相對表達量，比較兩組肝功能指標(ALT、AST和Alb)、細胞因子(TGF-β1、TNF-α和IL-6)水平的差異，分析肝纖維化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表達水平與肝功能和細胞因子水平的相關性。

四、統計學處理

數據錄入后，采用SPSS 11.5軟件進行分析。計數和計量資料則應用例和均數±標準差進行處理。選用t檢驗對患者肝組織Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ等細胞因子表達水平進行分析，同時借助Pearson相關分析法分析肝纖維化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表達水平與肝功能間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、兩組患者肝組織Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ相對表達量比較肝纖維化患者肝組織Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ相對表達量低于對照組(P均<0.001)。見表1。

表1 兩組患者肝組織Ac-SDKP、Smad7

二、兩組患者肝功能指標比較

肝纖維化患者的ALT、AST水平均高于對照組(P均<0.001)。見表2。

表2 兩組患者肝功能指標的比較

三、兩組患者細胞因子水平的比較

肝纖維化患者TGF-β1、TNF-α和IL-6水平均高于對照組(P均<0.001)。見表3。

表3 兩組患者細胞因子水平的比較

四、肝纖維化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ與肝功能和細胞因子的相關性

肝纖維化患者的Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表達量與ALT、AST、Alb、TGF-β1、TNF-α和IL-6水平負相關(P均<0.05)。

討 論

本研究中，肝纖維化患者TGF-β1水平顯著高于對照組，證實TGF-β1是肝纖維化的重要危險因子。既往研究顯示，TNF-α和IL-6也是肝纖維化的重要參與因子，這與該兩種物質介導的炎癥反應有關[5]。本研究中，肝纖維化患者TNF-α和IL-6水平高于對照組。有研究發現TNF-α還可促大鼠肝細胞合成大量膠原蛋白及蛋白多糖；而IL-6則對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白具有促進作用[6]，表明TNF-α和IL-6還可通過影響細胞外基質合成、降解來參與肝纖維化。

Smad7作為TGF-β信號轉導的負調控因子，可有效阻滯TGF-β信號的轉導。肝臟損傷時，自分泌TGF-β激活肝星狀細胞，同時TGF-β可促使Smad7一過性高表達，以實現TGF-β/Smads信號通路的正負平衡[7]。而Smad7的活化將抑制TGF-β受體TR1對Smad7家族成員Smad2、Smad3的磷酸化，同時促進TR1的自降解，阻滯TGF-β信號轉導。提示Smad7對TGF-β具有負反饋調節能力。本研究中，肝纖維化患者肝組織Smad7相對表達量高于對照組，這與Smad7的TGF-β負反饋調節能力有關。Ac-SDKP具有促細胞黏附、促炎性細胞趨化以及降解細胞外基質功能。Ac-SDKP可抑制AngⅡ誘導的肌成纖維細胞增殖、分化能力，同時還可抑制Ⅰ型膠原蛋白的表達[8]。本研究中，肝纖維化患者肝組織Ac-SDKP相對表達量高于對照組，說明肝纖維化患者Ac-SDKP應激性增高。PPAR-γ具有多種生物活性，其在炎癥、細胞質增殖、細胞凋亡、脂質代謝等生理活動中發揮重要作用[9]。本研究中，肝纖維化患者肝組織PPAR-γ相對表達量高于對照組，表明PPAR-γ與肝纖維化密切相關。肝纖維化大鼠PPAR-γ可通過抑制FAK下游PI3K/AKT信號通路的激活，并以此抑制纖維化發展，這可能是本研究中肝纖維化患者肝組織PPAR-γ相對高表達的原因[10]。隨后的相關性研究顯示，肝纖維化患者的Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表達量與ALT、AST、TGF-β1、TNF-α和IL-6水平負相關，表明肝纖維化患者疾病嚴重程度與其Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ水平相關，提示Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ或可成為肝纖維化診斷及嚴重程度評估的重要指標。