中國蘭花苞基因組DNA的提取及優化

林成立

(福建省林業科技試驗中心，福建 南靖 363600)

DNA是生物遺傳信息的載體和主要的遺傳物質。隨著分子生物學在花卉研究中的廣泛應用，花卉的基因組測序、分子輔助育種、遺傳工程等研究不斷深入[1-3]。目前已有許多物種的DNA提取方法被開發并成功應用，如菊花[4]、大花蕙蘭[5]、茉莉花[6]、梅花[7]、紅掌[8]、獼猴桃[9]等植物的DNA提取方法已見報道。高質量的基因組DNA是進行分子生物學研究的基礎，但不同生物學材料的物質組成及含量不同，使得DNA的提取方法不同。去除多糖、多酚等雜質是提取高質量DNA的主要難題。多糖、多酚易與DNA形成難溶復合物，且多酚氧化后會形成不可逆褐色產物，干擾DNA的絮狀結構，導致提取質量不佳。目前，已有許多學者提出了去除多糖、多酚等雜質的解決辦法。閆玖英等[10]采用細胞裂解前加入干擾物清洗液，提高β-巰基乙醇和PVP濃度抑制多酚氧化，沉淀DNA時加入1/10體積3 mol·L-1NaAC，可有效去除果實中多糖和多酚等物質；謝志亮等[11]在異丙醇沉淀DNA前加入5 mol·L-1NaCl可有效去除多糖；張妙彬等[12]通過細胞裂解前加入清洗液獲得石斛基因組DNA；李建光等[13]利用多糖高鹽溶解原理成功獲得蛇皮果高質量的基因組DNA。

國蘭是原產于中國的蘭屬(Cymbidium)地生蘭類植物，其葉片DNA提取方法已見報道[14]。但采摘蘭花葉片對植株生長影響較大，尤其是部分稀有或名貴品種，而采摘花苞對植株生長的影響較小，可作為國蘭基因組DNA提取的首選材料。目前有關國蘭花苞DNA提取的研究鮮見報道。因此，本文以墨蘭‘企黑’為試材，在常規CTAB提取法的基礎上進行改良，探索國蘭花苞高質量基因組DNA的提取方法，以期為國蘭全基因DNA獲取提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

墨蘭‘企黑’采自福建省林業科技試驗中心蘭花種質資源圃。采摘新鮮花苞，液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存，備用。洗凈液：0.4 mol·L-1葡萄糖+3%可溶性PVP+10 mmol·L-1β-巰基乙醇；常規CTAB法裂解緩沖液：100 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)+20 mmol·L-1EDTA(pH8.0)+0.5 mol·L-1NaCl+1.5%SDS+10 mL·L-1β-巰基乙醇(現用現加)；改良CTAB法裂解緩沖液：100 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)+20 mmol·L-1EDTA(pH8.0)+0.5 mol·L-1NaCl+1.5%SDS；體積比為24∶1的氯仿/異戊醇；5 mol·L-1NaCl溶液；TE緩沖液：10 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)+1 mmol·L-1EDTA(pH8.0)。

1.2 DNA提取方法

1.2.1 常規的CTAB提取法 稱取0.1 g花苞，用液氮充分研磨成粉末，快速轉移至1.5 mL離心管。用移液槍加入600 μL經70 ℃預熱的DNA裂解緩沖液，充分混勻，放入70 ℃水浴鍋水浴30 min，每隔5 min上下顛倒離心管，使細胞充分裂解。水浴后加入600 μL氯仿/異戊醇溶液，混勻，靜置10 min后以12 000 r·min-1離心10 min。取上清液至1.5 mL離心管并加入等體積異丙醇，混勻后可見絮狀物，靜置5 min，4 ℃下10 000 r·min-1離心5 min。棄上清液，加入200 μL 75%酒精清洗沉淀，4 ℃下3 000 r·min-1離心1 min(重復1次)，充分晾干后溶解于TE緩沖溶液中，于-40 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 改良的CTAB提取法 稱取0.1 g花苞，用液氮充分研磨成粉末，加入1 mL 洗凈液繼續研磨至糊狀后轉移至1.5 mL離心管中，常溫下以13 000 r·min-1離心10 min。用移液槍將膠狀物迅速吸出(底部沉淀與上清液間)，加入600 μL裂解緩沖液和150 μL無水乙醇，充分混勻后于70 ℃水浴鍋水浴30 min，每隔5 min上下顛倒混勻。水浴后加入600 μL氯仿/異戊醇溶液，靜置10 min，常溫下以13 000 r·min-1離心10 min。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇溶液，靜置10 min，常溫下以13 000 r·min-1離心10 min。取上清液并轉移至新的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇和1/2體積5 mol·L-1NaCl溶液(進一步去除多糖和多酚類物質[13])，混勻，常溫下靜置5 min。4 ℃下10 000 r·min-1離心5 min。棄上清液，加入200 μL 75%酒精清洗沉淀，4 ℃下3 000 r·min-1離心1 min(重復1次)，充分晾干后溶解于TE緩沖溶液中，于-40 ℃冰箱保存，備用。

1.3 DNA質量檢測

取3 μL DNA提取物與2 μL Loading buffer混勻，在1%瓊脂糖凝膠中電泳30 min(電泳儀型號：BIO-RAD PowerPac Universal；電泳緩沖液：1×TAE；電泳電壓：150 V)。使用電泳凝膠成像系統(型號：BIO-RAD Gel DOCTMXR+)檢測DNA的完整性。使用超微量核酸測定儀(型號：Thermo NANODROP ONE)測定DNA的提取濃度、D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm。

1.4 PCR擴增

選擇ISSR分子標記引物UBC842為引物，對DNA提取物進行PCR擴增檢驗(PCR儀型號：BIO-RAD T100TM)。20 μL反應體系為：60 ng DNA模板，0.25 μL引物(10 mmol·L-1,北京六合華大基因科技有限公司)，10 μL 2×Taq PCR SuperMix預混酶(北京全式金生物技術有限公司)，無菌水補足至20 μL； PCR程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 變性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，45個循環，72 ℃充分延伸5 min，4 ℃待機保存。

2 結果與分析

2.1 墨蘭‘企黑’花苞基因組DNA提取濃度及質量檢測

A.常規CTAB法；B.改良CTAB法。圖1 DNA提取物電泳圖Figure 1 Electropherograms of extracted DNA

墨蘭‘企黑’花苞基因組DNA電泳圖見圖1，其提取物質量檢測結果見表1。采用常規CTAB法提取‘企黑’花苞DNA，發現大部分DNA抱團滯留在樣孔中(圖1A)；DNA提取物濃度高達1 837.5～2 024.5 ng·μL-1，但3個試樣DNA提取物的D260 nm/D280 nm均<1.5，D260 nm/D230 nm均<0.8(表1)，表明DNA可能被蛋白質、多糖、多酚等雜質污染，提取物粘稠，甚至膠狀抱團。采用改良的CTAB法提取‘企黑’花苞DNA，其電泳圖(圖1B)顯示DNA條帶清晰、無拖帶、無RNA污染；D260 nm/D280 nm介于1.78～1.81之間，D260 nm/D230 nm介于1.99～2.12之間，DNA濃度為216.5～245.8 ng·μL-1(表1)，說明改良CTAB法提取的DNA濃度低于常規方法。這主要由于純化步驟造成一部分DNA損失，但改良后的提取濃度足以滿足大部分分子生物學實驗要求[5，13-14]。

表1 DNA提取產物質量檢測Table 1 Quality testing of extracted DNA

1)編號對應圖1電泳圖泳道。

2.2 PCR擴增檢驗

圖2 PCR擴增檢驗電泳圖Figure 2 Electropherograms of amplified PCR products

PCR擴增是大多數分子標記、基因克隆等分子生物學研究的技術基礎，DNA提取物質量合格與否直接影響PCR擴增的成敗。為進一步檢驗改良CTAB法提取的‘企黑’花苞基因組DNA質量，采用ISSR分子標記引物UBC842進行PCR擴增檢驗(圖2)。由圖2可知，PCR擴增條帶清晰、無拖帶，表明采用該方法提取的DNA質量合格，可以作為后續分子標記、基因克隆等分子生物學研究的PCR擴增模板。

3 討論

國蘭花苞富含多糖、多酚等次生代謝物質，提取過程中易出現抱團成膠、提取產物粘稠、電泳時DNA滯留在樣孔中等問題。本研究采用常規CTAB法提取墨蘭‘企黑’DNA，發現使用異丙醇沉淀核酸后出現沉淀抱團成膠、無法溶解的現象，這主要是由于花苞中可能含有易包裹DNA的多糖物質，使得DNA難以溶解。且提取過程中，多酚類物質與不可逆氧化成醌類物質發生褐變，而與DNA結合成不可逆復合物，導致DNA純度下降。為了解決上述問題，本研究利用活細胞中細胞區室化，多糖、多酚及其他雜質與DNA相互隔離的原理[15]，在裂解細胞核前加入洗凈液以除去細胞質中大部分組分，發現改良后的CTAB法可有效防止多酚類物質被氧化，提取到高質量的國蘭花苞基因組DNA。

多糖與DNA具有相似的理化性質，易與DNA一起沉淀，影響DNA的提取。但除去多糖的同時也容易帶走DNA，從而降低提取率。CTAB提取法是一種低成本、低毒、操作簡單的DNA提取方法，針對不同材料進行一定程度的優化均能取得不錯的效果[9]。本研究表明，僅在細胞裂解前加入洗凈液，提取產物依然存在一定程度的粘稠及拖帶現象。低濃度乙醇(10%～30%)可以沉淀多糖[16-17]及在沉淀DNA的同時加入1/2體積NaCl(5 mol·L-1)能有效去除多糖[18]。本研究在裂解細胞核離心后，加入1/4體積的無水乙醇，以沉淀上清液中的多糖，并在沉淀DNA的同時加入1/2體積NaCl(5 mol·L-1)以充分去除多糖。該方法可以有效提取高質量的國蘭花苞基因組DNA。