番茄粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌FocTR4的抑制效果

劉 范, 田 娜, 孫雪麗, 郝向陽(yáng), 項(xiàng)蕾蕾, 賴鐘雄, 程春振

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

番茄是一種藥食兼用的果蔬類食物[1]，不但營(yíng)養(yǎng)豐富，還具有一定的抑菌作用[2-3]。番茄莖葉揮發(fā)性成分[4]和水粗提物活性成分[5]對(duì)細(xì)菌和霉菌都具有抑制作用，且葉揮發(fā)性成分和水粗提物的抑菌效果均優(yōu)于莖；青果粗提液對(duì)青霉、黑曲霉和灰霉葡萄孢等也具有較好的抑制效果[6]。此外番茄提取物對(duì)植物病原菌也有較好的抑制效果。楊從軍等[7]發(fā)現(xiàn)，200 g·L-1番茄莖葉水提取物對(duì)蘋果輪紋病菌和棉花枯萎病菌的抑制率大于78%，對(duì)瓜類枯萎病菌的抑制率大于67%。楊柳等[8]發(fā)現(xiàn)，200 mg·mL-1番茄莖葉乙醇提取物對(duì)葡萄白腐病菌和棉花枯萎病菌的抑制率大于90%，且對(duì)番茄早疫病菌和蘋果斑點(diǎn)病菌也有一定的抑制作用。

由尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusariumoxysporumf.sp.Cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病是嚴(yán)重威脅香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的毀滅性土傳真菌病害，尚無有效的根治方法[9-11]。目前防治香蕉枯萎病主要通過生物、化學(xué)技術(shù)及輪作等途徑[12]。黃永紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，韭菜提取物和韭菜殘?bào)w處理能夠減少香蕉枯萎病的發(fā)生，因此韭菜—香蕉輪作常被用作防治香蕉枯萎病的重要手段。鑒于番茄提取物具有較好的抑菌效果，本研究擬對(duì)番茄不同器官粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種(Foctropical race 4,FocTR4)生長(zhǎng)的影響展開研究，以探索番茄提取物應(yīng)用于香蕉枯萎病防治的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉枯萎病菌FocTR4和2月齡的抗番茄枯萎病、黃萎病以及灰霉病的‘倍盈’番茄植株均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 番茄粗提物的提取

取‘倍盈’番茄植株根、莖、葉，自來水沖洗干凈后再用無菌水沖洗2～3次。用濾紙吸干表面水分，分別稱取20 g置于榨汁機(jī)中。加入50 mL無菌水打磨成勻漿，用兩層紗布過濾收集濾液。向?yàn)V液中加無菌水至總體積100 mL，5 000 r·min-1離心5 min后吸取上清液。在超凈工作臺(tái)中使用0.22 μm過濾頭(MILLEX公司生產(chǎn))將上清液過濾除菌，加無菌水定容至100 mL，即獲得200 g·L-1番茄根、莖、葉粗提物溶液。

1.3 番茄粗提物培養(yǎng)基制備

將10、6.67、5 mL番茄葉提取物分別加到50 mL離心管中并加入50～60 ℃的PDA培養(yǎng)基定容至20 mL，搖勻后倒入直徑為8.5 cm的培養(yǎng)皿中，獲得含有高濃度(100.0 g·L-1)、中濃度(66.7 g·L-1)、低濃度(50.0 g·L-1)番茄葉粗提物的PDA培養(yǎng)基。含有相同濃度的莖、根粗提物的PDA培養(yǎng)基配制方法同上。以加入等體積無菌水的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.4 FocTR4菌落培養(yǎng)與觀察

使用滅菌的黃色槍頭(內(nèi)徑為5 mm)在培養(yǎng)7 d的FocTR4菌落邊緣打孔，獲得FocTR4菌塊。將菌塊倒置于含有不同濃度番茄根、莖、葉粗提物的PDA培養(yǎng)基中央。于28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每種處理重復(fù)3次。以接種在等濃度無菌水PDA培養(yǎng)基中的菌落為對(duì)照。接種后每天測(cè)量菌落直徑并拍照，直至所有FocTR4長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。參照李吉慶等[14]的方法計(jì)算番茄粗提物對(duì)FocTR4的抑制率。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)的影響

2.1.1 葉粗提物 從表1～3可看出，F(xiàn)ocTR4菌落在含有番茄葉粗提物的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢。含有高濃度(100 g·L-1)葉粗提物培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌絲覆蓋1/2、2/3和全皿的時(shí)間分別比同濃度對(duì)照(分別為第4、5、8天)推遲2、3、5 d(表1)；中濃度(66.7 g·L-1)分別比同濃度對(duì)照推遲1、1、2 d(表2)；低濃度(50 g·L-1)分別推遲1、1、0 d(表3)。含高濃度葉粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在1～11 d時(shí)極顯著小于對(duì)照(P<0.01)；含中濃度葉粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在1～9 d時(shí)極顯著小于對(duì)照(P<0.01)；而含低濃度葉粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在1～7 d時(shí)極顯著小于對(duì)照(P<0.01)，第8天顯著小于對(duì)照(P<0.05)。

2.1.2 莖粗提物 番茄莖和根粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)也表現(xiàn)出一定影響，莖的抑制作用略優(yōu)于根(表1～3)。在含高濃度莖粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在第1天時(shí)顯著小于對(duì)照(P<0.05)，2～8 d時(shí)極顯著小于對(duì)照(P<0.01)；在含中濃度莖粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在第1天時(shí)顯著小于對(duì)照(P<0.05)，2～7 d時(shí)極顯著小于對(duì)照(P<0.01)；而在含低濃度莖粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在第1天時(shí)顯著大于對(duì)照(P<0.05)，第2、5天極顯著小于對(duì)照(P<0.01)，第3、6天顯著小于對(duì)照(P<0.05)。

表1 高濃度(100.0 g·L-1)番茄粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)的影響1)Table 1 Effect of high concentration (100.0 g·L-1) tomato crude extracts on the growth of FocTR4

1)加粗為菌絲直徑超過全板的1/2；下劃線為菌絲直徑超過全板的2/3；相同培養(yǎng)天數(shù)附不同大小寫字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。

表2 中濃度(66.7 g·L-1)番茄粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)的影響1)Table 2 Effect of medium concentration (66.7 g·L-1) tomato crude extracts on the growth of FocTR4

1)加粗為菌絲直徑超過全板的1/2；下劃線為菌絲直徑超過全板的2/3；相同培養(yǎng)天數(shù)附不同大小寫字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。

2.1.3 根粗提物 番茄根粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)的影響較小(表1～3)。在含高濃度根粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在4～8 d極顯著小于對(duì)照(P<0.01)；在中濃度根粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在第2天和第4～8天極顯著小于對(duì)照(P<0.01)，第9天顯著小于對(duì)照(P<0.05)；而低濃度根粗提物的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ocTR4菌落直徑在第1、第4天極顯著大于對(duì)照(P<0.01)，第5天極顯著小于對(duì)照(P<0.01)。

表3 低濃度(50 g·L-1)番茄粗提物對(duì)FocTR4生長(zhǎng)的影響1)Table 3 Effect of low concentration (50 g·L-1) tomato crude extracts on the growth of FocTR4

1)加粗為菌絲直徑超過全板的1/2；下劃線為菌絲直徑超過全板的2/3；相同培養(yǎng)天數(shù)附不同大小寫字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。

2.2 番茄粗提物對(duì)FocTR4的抑制效果比較

通過計(jì)算不同部位番茄粗提物對(duì)FocTR4的抑制率，發(fā)現(xiàn)葉粗提物抑制率最高，且各濃度葉粗提物對(duì)FocTR4的抑制率均在培養(yǎng)第2天達(dá)到最大值(圖1A)。番茄莖、根粗提物對(duì)FocTR4的抑制作用較弱，均低于20%，莖的抑制作用略優(yōu)于根(圖1B、1C)。

A.葉粗提物;B.根粗提物;C.莖粗提物。圖1 番茄葉、莖、根粗提物對(duì)FocTR4的抑制率Figure 1 Inhibitory rates of crude extracts from tomato leaves, stems and roots on FocTR4

不同部位番茄粗提物對(duì)FocTR4抑制率的變化趨勢(shì)也有所不同。番茄葉粗提取物對(duì)FocTR4的抑制率大致表現(xiàn)為“先升后降”的趨勢(shì)(圖1A)。與葉粗提物抑制率變化趨勢(shì)不同，莖和中低濃度根粗提物對(duì)FocTR4的抑制率大致呈現(xiàn)“升—降—升—降”的趨勢(shì)(圖1B、1C)。而高濃度根粗提物的抑制率則表現(xiàn)為“先升后降”的趨勢(shì)(圖1C)。

不同濃度的番茄葉、莖粗提物對(duì)FocTR4的抑制效果由高到低依次為：高濃度>中濃度>低濃度(圖1A、1B)。而不同濃度番茄根粗提物對(duì)FocTR4的抑制效果則以中濃度最佳，略優(yōu)于高濃度，低濃度抑制效果最差(圖1C)。

3 討論

番茄含有大量α-番茄堿和脫氫番茄堿等抑菌活性成分[15-16]。Arneson et al[17]發(fā)現(xiàn)番茄堿對(duì)30種病原菌具有抑制作用。Itkin et al[18]發(fā)現(xiàn)番茄次堿可以顯著抑制炭疽菌的生長(zhǎng)。陶永霞等[16]發(fā)現(xiàn)番茄生物堿提取液對(duì)細(xì)菌和酵母菌有較強(qiáng)的抑制作用。Irving et al[19]發(fā)現(xiàn)番茄堿對(duì)尖孢鐮刀菌具有一定的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄粗提物對(duì)FocTR4的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，抑制效果依次為：葉>莖>根。已有研究表明，番茄根莖葉中番茄堿含量也依次為：葉>莖>根[20-23]，說明不同番茄粗提物對(duì)FocTR4抑制效果的差異可能與番茄堿含量有關(guān)。

本研究表明，番茄不同部位粗提物對(duì)FocTR4抑制率的變化趨勢(shì)差異較大。不同濃度葉粗提物對(duì)FocTR4的抑制率均在2 d達(dá)到最大值，之后開始緩慢下降。這可能由于FocTR4在培養(yǎng)初期(1 d)需要一個(gè)適應(yīng)階段因而長(zhǎng)勢(shì)均較慢、抑制率略低，在培養(yǎng)2 d時(shí)表現(xiàn)出較高的抑制率，之后隨著抑制物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分的消耗或降解，抑制效果逐步降低。高濃度的番茄根粗提物對(duì)FocTR4的抑制率呈“先升后降”的趨勢(shì)，并且7 d才達(dá)到最高值。根系是FocTR4等土生病原菌侵染和定殖的主要部位[24]，在植物—病原菌互作過程中，病原菌可以從根系中獲得養(yǎng)分以維持自身生長(zhǎng)[25]。高濃度番茄根粗提物對(duì)FocTR4的抑制率緩慢上升可能與根系中含有大量營(yíng)養(yǎng)成分供給其生長(zhǎng)有關(guān)。隨著利于FocTR4生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，抑制率逐步提高。莖和中低濃度根粗提物抑制率大致呈“升—降—升—降”的趨勢(shì)，這可能與番茄提取物及培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和抑菌物質(zhì)含量消耗及FocTR4生長(zhǎng)勢(shì)有關(guān)。

綜上可知，番茄葉和莖粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，具有應(yīng)用于香蕉枯萎病防治的潛質(zhì)，但粗提物的有效抑菌成分及最佳抑菌濃度需進(jìn)一步分離、鑒定。此外，本研究所用‘倍盈’番茄是抗枯萎病、黃萎病以及灰霉病的番茄品種。李偉明等[26]指出，含有番茄枯萎病抗性基因的番茄品種在接種FocTR4后不會(huì)出現(xiàn)枯萎病的癥狀，說明番茄枯萎病抗性品種中含有某些抑制FocTR4生長(zhǎng)或侵染的物質(zhì)。Friedman[27]指出，衰老葉中番茄堿含量最高，推測(cè)將廢棄莖葉還田可能會(huì)起到更好的抑菌效果。番茄秸稈還田具有改良土壤的功效[28]，因此在香蕉枯萎病防治過程中可以嘗試將番茄枯萎病抗性品種與香蕉輪作，之后將番茄莖葉還田，不僅能夠改良土壤，還有可能起到降低土壤中病原菌含量的作用。