順鉑誘導的急性腎臟損傷中KIM-1的作用研究

吳敬瑩

（安徽醫科大學第二附屬醫院藥學部 安徽 合肥 230601）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI），原名急性腎衰竭，是臨床常見危重病之一，其以腎功能在短時間內突然迅速下降為主要特點，并同時伴有一系列嚴重并發癥，臨床發病率逐年遞增[1]，為目前住院患者死亡的獨立危險因素之一。近年來大量的流行病學和臨床研究表明腎臟損傷因子-1（Kidney Injury Molecule-1，KIM-1）在腎臟損傷不同程度時會發生顯著變化，在腎臟疾病演變全過程中有著重要的意義，KIM-1系腎臟近曲小管上皮細胞一種跨膜糖蛋白，于正常腎組織表達量極低[2]。國外學者Kumar研究提示，在腎缺血、腎毒性等誘因所致的急性腎損傷患者中檢測到KIM-1表達水平顯著升高，探究原因其細胞外域經基質金屬蛋白酶作用分解為可溶性片段并釋放到細胞外，隨后排入尿液中[3]。AKI在臨床早期通常為可逆性損害，如能早期診斷，同時積極針對原發病治療，消除誘因可有效避免其進展為實質性腎衰竭，但鑒于此類疾病初期臨床癥狀及體征缺乏特征性，在臨床實際診療過程中極易出現誤診或漏診，導致部分患者錯失臨床治療的最佳時機[4]，故尋找有效的控制因子對于腎臟疾病尤其控制早期腎臟損傷具有重要的意義。

順鉑（Cis-diamine dichloropl atinum，CDDP）是臨床最常用治療實體性腫瘤療效確切的藥物之一，其臨床療效多與臨床用藥劑量成相關，但其藥物毒性尤其腎毒性也與劑量正相關。CDDP的生物活性取決于人體內環境中氯離子濃度，在氯離子濃度較高的血液及細胞外，CDDP相對穩定，一旦其進入氯離子濃度很低的細胞液中后，CDDP中的兩個氯離子會被水所取代，形成水合物。而形成的這種水合物極易與DNA發生加成反應，形成交聯，破壞DNA的復制轉錄，導致細胞增殖周期停滯，致使細胞凋亡。探究CDDP誘發腎毒性原因，發現其主要原因是由氧化應激引起的氧化性損傷，損傷機制主要有二：一為大量氧自由基的生成，二則是自由基清除劑減少、受抑。本文就CDDP誘導的鼠急性腎損傷中KIM-1的作用進行研究和探討，旨在為腎臟損傷早期尋找有效的控制因子。

1.資料與方法

1.1 一般資料

自安徽醫科大學實驗動物中心購買健康清潔級雄性C57小鼠20只，體質量17～20g，動物使用許可證號（SYXK（皖）2017-006）。按隨機數字表法將小鼠分為實驗組和對照組，每組10只；正常喂養1周后進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 實驗組小鼠按10mg/kg腹腔注射CDDP，以造成小鼠急性腎損傷模型。對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。

1.2.2 樣本采集 用戊巴比妥鈉麻醉小鼠（10%，麻醉后處死），取各組小鼠腎臟組織。-80°冰箱保存，對小鼠腎臟組織進行剝離，中間段進行病理學檢測，兩邊進行提取組織蛋白進而對相應蛋白含量進行檢測。

1.2.3 免疫組織化學檢測 取每組10只小鼠腎臟組織固定24h后，按常規制作蠟塊、切片，進行KIM-1免疫組織化學檢測。

1.2.4 Westernblot檢測 稱量組織1000mg腎臟組織，加入10μl蛋白裂解液（1ml RIPA:10μl PMSF），于冰上裂解30min，不間斷晃動培養瓶或六孔板；再將裂解液、細胞碎片轉至預冷的1.5mlEP管中，渦旋數次至裂解充分；經過4℃，12000rpm，30min離心后；移入上清液至新的1.5mlEP管中（記錄上清液體積）；蛋白定量；加入5×蛋白上樣緩沖液，4個體積的蛋白溶液加一個體積的5×蛋白上樣緩沖液，混勻，分裝于0.5ml EP管中；100℃，10min，使蛋白充分變性；提取符合濃度純度要求的蛋白，置-20℃保存。

Westernblot顯影結果采用Image-Pro Plus圖像處理系統進行分析光密度，量化蛋白表達水平。

1.3 統計學方法

數據處理采用SPSS17.0軟件。計量資料用均數±標準差表示，采用重復測量方差分析；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 模型結果

2.1.1 免疫組織化學結果 腎臟病理結果顯示，實驗組小鼠腎臟KIM-1陽性表達顯著增高，對照組小鼠腎臟損傷因子棕黃色陽性表達相對于模型組顯著減少（圖1）。

圖1 兩組腎臟組織免疫組織化學檢查結果圖

2.2 Westernblot結果

兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖2）。

圖2 Westernblot結果

3.討論

本實驗研究旨在建立順鉑（Cis-diamine dichloro platinum，CDDP）誘導的急性腎損傷小鼠模型，檢測KIM-1在此模型中小鼠腎臟表達的不同。目前CDDP導致急性腎毒性的機制未完全明了，部分學者研究提示CDDP攝入機體內后能在腎組織濃聚，排泄途徑主要為經腎排泄，而這種腎組織濃集的特征性組織分布、以及主要由腎排泄特性，可能是其腎毒性的原因所在[5]。實驗通過CDDP的腎毒性誘導腎小管上皮細胞的壞死、細胞凋亡、炎癥介質損傷等機制產生急性腎損傷。目前研究表明KIM-1作為一種新Ⅰ型跨膜糖蛋白，其結構包括胞質區、跨膜區、信號肽、黏蛋白結構域、特征性Ig結構域等，通常KIM-1在正常肝、腎及脾組織呈微量或低量表達，但在急性腎損傷后再生的近曲小管上皮細胞中表達量顯著提高，提示與急性腎損傷嚴重程度相關性強，表明其在腎小管上皮細胞早期損傷及修復、腎間質纖維化修復中均具有重要作用，同時具有信號傳導、黏附及參與免疫反應等功能。研究提示KIM-1細胞外域經基質金屬蛋白酶作用分解為可溶性片段，并釋放到細胞外，隨后排入尿液中，故可于尿液中檢測出KIM-1可溶性片段。學者趙進等研究提示，在臨床腎缺血導致急性腎小管壞死患者尿液中，KIM-1表達水平顯著升高，KIM-1尿液中測定值為其他急性腎損傷因素導致的急性腎小管壞死患者數值約4倍，其次誘因是臨床造影使用的對比劑所致的急性腎小管壞死[6]。

筆者動物實驗結果同樣顯示，在實驗組中病理學水平和蛋白水平均呈現出KIM-1的高表達，無論腎毒性還是腎缺血所致腎損傷，尿KIM-1作為評估腎損傷的標志物優于BUNSCR及尿NAGL這些傳統的指標。因此提示KIM-1是種可靠的早期檢測腎損傷的生物學標志物。