p38 MAPK阻滯劑對百草枯中毒急性肺損傷中TNF-α的影響

周志兵 張劍鋒（通訊作者） 向瀝 李霽 羅毅豐

（廣西壯族自治區廣西醫科大學第二附屬醫院急診科 廣西 南寧 530007）

百草枯（paraquat poisoning，PQ）是民間常用的廉價除草劑，除草效果好而被廣泛應用，因此也成為了急診病人常見的中毒原因之一[1]。既往研究發現，PQ中毒的病人早期即可發現肺組織的彌漫性炎癥反應，以急性肺損傷病理變現為主，出現上皮細胞損傷，肺泡內的水腫和出血，大量的炎性細胞浸潤，晚期導致以肺損傷為主的多器官功能障礙綜合征[2]。百草枯中毒救治成功率低，致死率高達60%～90%。目前關于百草枯中毒的機制尚不明確，研究表明炎癥反應失衡以及氧化應激是百草枯中毒的重要機制，本課題組前期研究發現腫瘤壞死因子TNF-α作為重要的炎癥介質在百草枯中毒大鼠中是增高的[3]。p38屬于MAPK家族中的一員，它作為上游的環境壓力應激反應蛋白而能影響TNF-α的表達，關于p38 MAPK阻滯劑在百草枯中毒急性肺損傷大鼠中對TNF-α的影響的報導罕見，本研究將以百草枯灌胃來制作百草枯中毒急性肺損傷大鼠模型，應用p38 MAPK阻滯劑SB203580干預后，觀察肺組織中TNF-α的變化。

1.資料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SPF級雄性SD大鼠36只，體重200～250g，由廣西醫科大學動物中心提供，動物使用許可證：SYXK桂2014-0003。飼養溫度（20±2）℃，自由進水，普通飼料喂養。

1.2 主要試劑、藥品和儀器

二氯百草枯結晶體（Sigma公司，美國），p38 MAPK阻滯劑SB203580，RNA保存液，RNA提取試劑盒，逆轉錄試劑盒購于TaKaRa公司，ELISA 試劑盒購于華美公司，目的基因引物序列設計合成由南寧科迪公司完成。目的基因堿基序列：β-actin上游引物5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'；TNF-α上游引物5'-GGCGTGTTCATCCGTTCTC-3'，下游引物為5'-CTTCAGCGTCTCGTGTGTTTCT-3'；p38MAPK 上 游引 物5'-GTGTCGGTGATGTCAGATGG-3'，下游引物：5'-CAGTATGCAGTCCAGCTCCA-3'。病理圖像分析系統（Leica公司，德國）。

1.3 方法

1.3.1 模型制作與分組 將36只大鼠按照隨機數字法分成3組，其中生理鹽水對照組（NS組）12只，百草枯模型組（PQ組）12只，p38 MAPK阻滯劑干預組（PQ＋SB組）12只。PQ組和PQ＋SB組均給予100mg/kg的百草枯一次性灌胃；NS組給予大鼠與百草枯等量的生理鹽水灌胃。p38 MAPK阻滯劑組在灌胃后立即給予10mg/kg/天SB203580腹腔注射，并每24h重復給予SB203580一次，分別于灌胃后1d、3d后處死并留取標本，本實驗動物處置方法符合動物倫理學標準。

表1 第 1、3天各組大鼠肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的相對表達比較（±s）

表1 第 1、3天各組大鼠肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的相對表達比較（±s）

注：與NS組第1天相比，①P＜0.05，⑤P＜0.05；與NS組第3天相比，②P＜0.05，⑥P＜0.05；與PQ組第1天相比，③P＜0.05，⑦P＜0.05；與PQ組第3天相比，④P＜0.05，⑧P＜0.05；在PQ組內第1天與第3天相比，⑨P＜0.05；在PQ+SB組內第1天與第3天相比，⑩P＞0.05；在PQ組內第1天與第3天相比，?P＜0.05；在PQ+SB組內第1天與第3天相比，?P＜0.05。

TNF-α p38 MAPK PQ組 PQ+SB組 PQ組 PQ+SB組NS組 第1天 1.954812±0.335586① - 2.199330±0.195087⑤ -第3天 4.111881±0.997487② - 3.475220±0.431125⑥ -PQ組 第1天 - 0.190781±0.030778③ - 0.534773±0.014130⑦第3天 2.109590±0.422647⑨ 0.062689±0.034125④ 1.577948±0.083984? 0.169343±0.016417⑧PQ+SB組 第1天 - - - -第3天 - 0.878399±0.454120⑩ - 0.500709±0.065733?

1.3.2 標本采集 10%水合氯醛以0.03ml/kg進行腹腔注射麻醉，打開腹腔，腹主動脈放血處死，剖開頸部皮膚暴露氣管，同時開胸暴露心肺及大血管，結扎左側肺門以后使用10ml注射器吸取PBS緩沖液扎入右心室從而灌注沖洗肺中血液。取以下樣本：①結扎左主支氣管，行支氣管肺泡灌洗（BALF），收集灌洗液于2000rpm離心15min，留取上清，并分裝入 1.5ml EP管內置于-80℃冰箱中保存備用。②取右下肺用RNA保存液畳于-20℃攝氏度冰箱保存備用，待做Real-time PCR檢測，余下肺保存備用；3、左肺10%甲醛固定48h，后續病理檢測。

1.3.3 標本病理染色檢測 取48h固定后的左肺，脫水、浸蠟、包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色，應用病理圖像分析系統，使用光學顯微鏡對肺組織的病理變化進行觀察。

1.3.4 取肺泡灌洗液 按TNF-a的Elisa試劑盒說明書操作，測得OD值，通過標準曲線算出濃度。

1.3.5 各組大鼠肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的檢測采用qRT-PCR 法 使用RNA提取試劑盒對肺組織總RNA進行提取，用逆轉錄試劑盒逆轉錄 RNA 成cDNA。內參選用β-actin，選擇20μL體系進行qRT-PCR擴增。用2-△△CT表示受檢組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的相對表達量。

1.4 統計學方法

2.結果

實驗開始后，NS組大鼠進食正常，毛發順白，精神狀態尚好，行動自如。PQ組大鼠進食、飲水量較NS組減少，毛發粗糙、稀疏，精神疲、行動緩慢，易激惹，口唇及鼻部偶見血性分泌物。PQ＋SB組大鼠可見與PQ組類似的中毒癥狀，但癥狀較PQ組輕。

2.1 肺組織病理學改變 NS組的大鼠肺大體觀呈均勻粉紅色，包膜光滑、柔軟、彈性好；光鏡下觀察組織結構清晰，肺泡腔無炎性細胞浸潤，肺泡壁薄，間質血管無擴張，支氣管黏膜上皮完整。PQ組的大鼠未灌洗之前肺大體觀可見組織腫脹，色不均勻，表面可見大面積出血點；光鏡下組織內可見較多肺泡萎陷，肺泡壁毛細血管擴張、淤血，伴灶性肺泡內出血，部分肺泡腔內有水腫液，肺內可見大量炎癥細胞浸潤，肺間質水腫，肺泡間隔不同程度增寬。PQ＋SB組的大鼠肺組織病變輕于染毒組，肺泡內出血及炎癥細胞浸潤減少，肺間質水腫程度減輕。見圖。

圖 大鼠肺組織病理學變化

2.2 各組大鼠肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的表達比較

PQ組大鼠在第1、3天肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的表達量均高于相同時間點NS組（P均＜0.05）；PQ＋SB組第1、3天大鼠肺組織中則表達量明顯低于相同時間點PQ組（P均＜0.05）。PQ組內不同時間點的大鼠肺組織中TNF-α和p38 MAPK mRNA的表達量差異有統計學意義（P＜0.05）；PQ+SB組組內不同時間點的大鼠肺組織中TNF-α mRNA的表達量差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平比較

PQ組在第1、3天大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平與NS組相比有明顯差異（P＜0.05）；PQ＋SB組第1天大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平與PQ組相比差異無統計學意義（P＞0.05），而在第3天則明顯低于PQ組（P＜0.05）。PQ組和PQ＋SB組同一組內的不同時間點的大鼠肺泡灌洗液TNF-α蛋白水平差異無統計學意義（P均＞0.05），見表2

表2 第 1、3天各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α蛋白的表達比較(ng/ml,±s)

表2 第 1、3天各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α蛋白的表達比較(ng/ml,±s)

注：與NS組第1天相比，①P＜0.05；與NS組第3天相比，②P＜0.05；與PQ組第1天相比，③P＞0.05；與PQ組第3天相比，④P＜0.05。

組別 TNF-α第1天 第3天PQ組 0.221268±0.042217① 0.265178±0.011183②SB組 0.194063±0.015772③ 0.152062±0.022503④NS組 0.021573±0.011077 0.029496±0.005304

3.討論

百草枯病人存活率低，尚未有良好的治療方法。病人食入后由于無法及時洗胃常常已經吸收，而百草枯早期可與胺類物質競爭肺泡Ⅱ型細胞的能量依賴性多胺攝取途徑而選擇性地在肺內聚集[4]。這種攝取系統主要存在于肺泡Ⅱ型細胞，同時也存在于氣管Clara細胞和肺泡Ⅰ型細胞[5]。因此早期發現病人時百草枯往往已經在肺中積累較高濃度，而目前研究發現的百草枯中毒機制包括了氧自由基損傷、氧化應激損傷、胞內鈣穩態失衡、炎癥反應失衡、線粒體損傷、DNA 損傷與細胞凋亡等[6]。眾多研究發現炎癥反應在百草枯中毒的病理發展進程中起重要作用，Yang S等[7]提出PQ中毒早期有大量炎性細胞和免疫細胞浸潤，其能分泌多種炎性介質，而炎性介質再反過來促進炎性細胞的浸潤。

p38 MAPK屬于MAPK家族中的一員，是一條極其重要的環境壓力應激反應通路。p38 MAPK最初被認為是LPS刺激的巨噬細胞中檢測到的一種酪氨酸磷酸化蛋白，對炎癥細胞因子的產生具有重要作用，是亞砷酸鹽、熱休克或白介素-1刺激的細胞中MAPK活化蛋白激酶2（MK2）的上游激活激酶[8]。廣泛的研究表明，p38 MAPK在許多不同的組織中發揮著關鍵作用[9]。而Wang,X[10]等發現在百草枯中毒急性腎損傷中p38 MAPK的磷酸化是增加的。TNF-α則主要由淋巴細胞、激活的巨噬細胞、內皮細胞、肥大細胞、成纖維細胞等分泌。參于了機體的炎癥反應和免疫過程，是介導機體炎癥反應的關鍵因子[11]。

本實驗采用百草枯灌胃法，以100mg/kg的劑量來構建大鼠急性肺損傷模型，病理形態學上可見PQ組明顯較同一時間點的NS組炎癥明顯，肺組織損傷加重，這與課題組前期構建的百草枯中毒急性肺損傷模型病理表現相同[12]。而應用了p38 MAPK阻滯劑后，則改善了PQ所致的肺組織的損傷。SB203580是一種被應用廣泛的高效p38 MAPK阻滯劑，Chen X[13-14]等人用該阻滯劑制作了相關模型，發現成功降低了p38的磷酸化。通過本次實驗結果，我們發現肺組織中的TNF-α和p38 MAPK mRNA表達在PQ組的表達均高于同一時間點的NS組，而應用阻滯劑后在同樣時間點則明顯降低了TNF-α和p38 MAPK mRNA的表達。但是同一組內,只有PQ組TNF-αmRNA隨時間增加而增高，PQ+SB組無明顯差異。這可能是由于p38阻滯劑作用于百草枯中毒的大鼠后，對TNF-αmRNA干預的降低速率在三天內較慢。檢測肺泡灌洗液中的TNF-α蛋白表達水平發現，PQ組不同時間點表達均高于NS組，而應用阻滯劑后在第1天無明顯差異，在第三天則能降低TNF-α蛋白表達水平。PQ+SB組也未能表現出TNF-α蛋白水平的時間依賴性減低。說明在p38 MAPK阻滯劑干預后，百草枯中毒肺組織中的炎癥介質TNF-α蛋白表達水平在第一天的影響不明顯，而在第三天可以見到明顯的降低。由p38 MAPK的直接作用底物可知[15]，TNF-α本身不是p38 MAPK的直接作用底物，而是經過中間相關分子后影響TNF-α的表達。YU[16]等做的模型中認為p38 MAPK能影響核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）的磷酸化，而NF-κB能影響TNF-α的轉錄。因此可解釋其在一天內的影響并不明顯。

綜上，百草枯致急性肺損傷時，p38 MAPK阻滯劑可以抑制肺組織中TNF-α蛋白和mRNA的表達，改善肺組織的炎癥反應，從而減輕肺損傷，這提示了在百草枯中毒急性肺損傷過程中，p38 MAPK可以通過影響TNF-α的表達，從而影響肺損傷時的肺組織炎癥反應。