呋喃西林代謝物單克隆抗體及熒光免疫層析試紙條的制備

郭會燦 崔海波 徐冬梅

摘 要：為建立一種基于熒光免疫層析技術的呋喃西林代謝物的快速檢測方法，采用活性酯法合成呋喃西林代謝物（氨基脲鹽酸鹽）（semicarbazide hydrochloride，SEM）人工抗原，并獲得SEM的單克隆抗體，通過將量子點微球（quantumdot submicrobeads，QBs）與SEM偶聯(lián)，得到QBs探針，制備熒光免疫層析試紙條。結果表明：SEM免疫熒光層析試紙條檢測魚肉組織的檢測限為0.247 μg/L，不同添加質量濃度的回收率均在70%～120%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均在15%以下，符合我國動物源食品中獸藥殘留檢測方法相關指導文件的規(guī)定，且在2～8 ℃條件下可以保存6 個月以上，穩(wěn)定性良好。

關鍵詞：呋喃西林代謝物;熒光免疫層析;免疫抗原;樣品預處理;量子點微球

Abstract： In order to establish a rapid fluorescence immunochromatography method for the detection of semicarbazide hydrochloride （SEM） as a furacilin metabolite， SEM hapten was synthesized and conjugated to bovine serum albumin （BSA） and ovalbumin （OVA） by the active ester method， and the hapten-protein conjugates were employed to obtain anti-SEM monoclonal antibody. Meanwhile， SEM was conjugated to quantumdot microspheres， yielding a probe. Finally，?a fluorescence immunochromatography test strip was prepared. The results showed that the detection limit of the test strip for fish meat was 0.247 μg/L. The recoveries of SEM from blank fish samples spiked at different concentrations were between 70% and 120%， and within and between batches coefficients of variation （CV） were below 15%， which was in accordance with the requirements for the determination of veterinary drug residues in animal-derived foods. The test strip was stable at?2–8 ℃ for up to 6 months.

Keywords： furasciline; fluorescence immunochromatography; immunogen; sample pretreatment; quantum dot microspheresDOI：10.7506/rlyj1001-8123-20181211-229

中圖分類號：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）03-0046-06

引文格式：

郭會燦， 崔海波， 徐冬梅. 呋喃西林代謝物單克隆抗體及熒光免疫層析試紙條的制備[J]. 肉類研究， 2019， 33（3）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20181211-229.? ? http：//www.rlyj.net.cn

GUO Huican， CUI Haibo， XU Dongmei. Preparation of monoclonal antibody and fluorescence immunochromatographic test strip for detecting furacilin metabolites[J]. Meat Research， 2019， 33（3）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20181211-229.? ? http：//www.rlyj.net.cn

呋喃西林（Nitrofural），又稱呋喃新、硝基呋喃腙、呋喃星，是一種硝基呋喃類藥物，是一種可以治療牲畜疾病的合成抗菌藥。動物源性食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物的殘留可通過食物鏈傳遞給人類并在機體內(nèi)富集，長期富集會導致毒性和致癌風險，這種危害已引起了世界各國的極大關注。美國、澳大利亞、日本、歐盟、加拿大及新加坡等國家明確規(guī)定禁止在食品工業(yè)中使用此類藥物[1-2]。各國嚴格執(zhí)行對水產(chǎn)中該類藥物的殘留檢測。殘留監(jiān)控措施主要從監(jiān)控計劃、抽樣、檢測、結果發(fā)布和處理五方面進行把控[3]。我國農(nóng)業(yè)部已將呋喃西林列入首批禁用藥第235號公告[4]，相關部門在全國范圍圍繞畜、禽、水產(chǎn)品的抗生素、禁用化合物及獸藥殘留超標等問題開展專項整治活動，嚴厲打擊包括硝基呋喃類在內(nèi)的藥物非法使用、生產(chǎn)和銷售。

呋喃類藥物及其代謝物在機體內(nèi)穩(wěn)定性很差，在弱酸條件下（如人類胃液的酸性條件）從蛋白質中釋放出來，在機體內(nèi)其代謝物與組織蛋白結合后，可以形成穩(wěn)定狀態(tài)的化合物[5]，其中呋喃西林在組織中結合的代謝產(chǎn)物滯留時間最長，相對毒性反應也最強，現(xiàn)在各國明令禁止其在畜牧生產(chǎn)活動中添加或使用，在這種大環(huán)境下對呋喃類藥物及其代謝物的研究及檢測對從源頭遏制此類藥物的濫用顯得尤為重要。

目前，對呋喃西林代謝物的檢測方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、分光光度法、免疫分析法（immunoassay，IA）等。于慧娟等[6]利用HPLC法測定水產(chǎn)品中呋喃唑酮的殘留量，方法靈敏度高，檢測限為1.0 μg/kg。

彭濤等[7]利用氣相色譜-質譜聯(lián)用（liquid chromatography with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法同時測定動物肌肉組織中4 種呋喃類藥物呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃西林的代謝物，呋喃它酮代謝物（5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxalidinone，AMOZ）和呋喃唑酮代謝物（3-amino-2-oxalidinone，AOZ）的定量限均為0.1 ng/g，呋喃西林代謝物（氨基脲鹽酸鹽）（semicarbazide hydrochloride，SEM）和呋喃妥因代謝物（1-amino-hydantoin，AHD）均為0.5 ng/g;AMOZ和AOZ的檢測限均為0.05 ng/g，SEM和AHD均為0.1 ng/g。Cooper等[8]建立了蝦組織中呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的酶聯(lián)免疫分析方法，檢測限為0.1 μg/kg。

色譜技術樣品處理過程繁瑣、耗時、成本高，而且需要經(jīng)過專門訓練的人員來操作復雜的設備，并且其復雜的前處理不適合篩選大批量樣品[9]。作為一種快速、靈敏、特異的檢測方法，熒光免疫層析方法是熱門且公認的快速檢測方法[10]。本研究先通過衍生化進行抗原合成，再通過細胞雜交瘤技術制備單克隆抗體，對能夠穩(wěn)定、特異性分泌抗呋喃西林代謝物衍生物單克隆抗體的雜交瘤細胞株進行建株，使用單克隆抗體建立用于檢測呋喃西林代謝物殘留的熒光免疫方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物BALB/c小鼠購自河北醫(yī)科大學。

1.1.2 藥品

鹽酸氨基脲（semicarbazide hydrochloride，SEM·HCl）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC）、二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA） 美國Sigma公司;N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）? ?索萊寶生物科技有限公司;鄰醛基苯甲酸（2-carboxybenzaldehyde，2-CBA）、對醛基苯甲酸（4-carboxybenzaldehyde，4-CBA） 阿拉丁試劑（上海）有限公司;無水甲醇?無錫亞泰聯(lián)合化工有限公司。

1.2 儀器與設備722紫外-可見分光光度計 上海光學儀器廠;JIDI-16R臺式多用途高速冷凍離心機 廣州吉迪儀器有限公司;MiLLi-Q Ingegral Lo超純水系統(tǒng) 德國密理博公司;BS 124S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司;T-Meter I熒光免疫分析儀 河北特溫特生物科技發(fā)展有限公司。1.3 方法

1.3.1 免疫抗原的制備

半抗原的合成[11]：將0.4 g 4-CBA加入到2 mL純水中，并將DMF緩緩加入上述溶液中，邊滴加邊攪拌直至4-CBA完全溶解，然后緩慢加入0.5 g SEM·HCl，并在室溫下反應4 h;過濾反應溶液，得到淡黃色固體，用純水洗滌3 次，在50 ℃條件下進行干燥，得到半抗原呋喃西林衍生物CPSEM（CP（羧基苯甲醛）與SEM的衍生物）。抗原的合成：稱取21 mg CPSEM溶于2 mL DMF中，緩慢加入溶有18 mg NHS的PBS緩沖液，攪拌反應5 min后，加入3 mL溶有40 mg EDC的0.01 mol/L PBS緩沖液，在室溫下攪拌2 h;稱取60 mg BSA溶于2 mL PBS中，然后將上述反應溶液緩慢加入，4 ℃攪拌過夜;0.01 mol/L PBS透析3 d，-20 ℃保存?zhèn)溆谩EM抗原合成路線圖如圖1所示。檢測原同法制備。

1.3.2 免疫抗原的鑒定

1.3.2.1 紫外掃描法

用PBS對CPSEM和BSA進行適當稀釋，測定BSA的蛋白濃度，把CPSEM-BSA稀釋到與BSA相同濃度，在220～700 nm波長下掃描，參考楊立國等[12]的方法計算BSA與CPSEM的分子偶聯(lián)比。

1.3.2.2 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）鑒定選擇分離凝膠為12%，濃縮凝膠為5%，通過SDS-PAGE對合成物進行鑒定。

1.3.2.3 免疫法

根據(jù)李春生等[13]的方法，通過CPSEM-BSA免疫BALB/c小鼠，并進行融合實驗。

1.3.3 熒光微球（quantum dot submicrobeads，QBs）標記SEM單克隆抗體

采用EDC法偶聯(lián)QBs和SEM抗體[14]：將QBs用0.1 mol/L、pH 5.5的MES溶液清洗2 遍，再用0.1 mol/L、pH 5.5的MES溶液5 mL復溶，10 000 r/min離心30 min，沉淀用MES溶液重懸，加入一定量的0.01 mol/L EDC，混合反應12 h;10 000 r/min離心30 min，沉淀用0.1 mol/L的Tris-1% Casein溶液復溶，混合反應4 h;10 000 r/min離心30 min，用0.1 mol/L的Tris-1%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）溶液復溶，制備得到將SEM抗體用QBs標記的產(chǎn)物，即QBs探針，4 ℃保存，備用。

1.3.4 硝化纖維素（nitrocellulose，NC）膜封閉條件的優(yōu)化通過改變NC膜封閉液的各組分濃度，來降低背景干擾和假陽性率。采用篩選的封閉液浸泡NC膜，37 ℃烘干4 h，之后用劃膜儀將T線和C線包被在NC膜上，37 ℃干燥3 h。干燥環(huán)境密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 熒光免疫層析試紙條的組成QBs熒光免疫層析試紙條的組成如圖2所示，其中QBs探針包被在結合墊上，SEM抗原作為T線、羊抗兔二抗作為C線噴涂在NC膜上。

1.3.6 樣品預處理

取2 g均質魚肉樣本于50 mL離心管中，依次加入4 mL去離子水、0.5 mL 1 mol/L HCl和100 μL 2-硝基苯甲醛，充分振蕩，置于60 ℃恒溫水浴孵育1 h;取出后依次加入5 mL 0.1 mol/L K2HPO4、0.4 mL 1 mol/L NaOH和5 mL乙酸乙酯，充分振蕩2 min，室溫條件下5 000 r/min離心10 min;取出2.5 mL乙酸乙酯層（上層）到5 mL離心管中，50 ℃氮氣吹干，加入1 mL正己烷溶解，加入1 mL PBS充分混合30 s;室溫條件下5 000 r/min離心10 min，取50 μL下層用于分析。

1.3.7 熒光免疫層析試紙條性能測試

1.3.7.1 檢測限

根據(jù)歐盟《動物源性食品中獸藥殘留檢測方法》的規(guī)定[15]，分別測定20 份魚肉組織空白樣品，按照1.3.6節(jié)的方法處理樣品，用回歸方程計算樣品殘留濃度，用SPSS軟件得出樣品濃度的平均值（）和標準差（s），以+3s作為魚肉組織的最低檢測限。

1.3.7.2 準確度

通過魚肉樣本添加回收實驗檢測熒光免疫層析試紙條的準確度[16-18]。在空白魚肉組織中添加不同質量濃度的待測物，按照1.3.6節(jié)的方法處理樣品，重復3 次，用熒光免疫層析試紙條進行測試，在熒光免疫分析儀上讀取檢測結果。按照公式（1）計算回收率。

1.3.7.3 精密度

精密度實驗結果用變異系數(shù)來表示[19-21]。取3 個批次的試劑盒進行批間和批內(nèi)測定，批間測定：向魚肉組織中添加2 個不同質量濃度的待測物，每個質量濃度重復測定5 次，得出和s;批內(nèi)測定：向魚肉組織中添加2 個不同質量濃度的待測物，進行重復測定，得出和s，計算變異系數(shù)，分析批內(nèi)和批間精密度。按照公式（2）計算變異系數(shù)。

1.3.7.4 穩(wěn)定性

將熒光免疫層析試紙條分為3 組，分別在2～8 ℃、37 ℃、-20 ℃溫度條件下進行穩(wěn)定性測試[22-24]。2～8 ℃條件下保存6 個月、每個月檢測1 次，37 ℃和-20 ℃條件下放置6 d、每天檢測1 次，測定陰性樣本的測定值和回收率等參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理采用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，Origin制圖軟件繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 人工合成SEM抗原的鑒定

2.1.1 紫外掃描法鑒定

由圖3可知，BSA的最大吸收峰在280 nm波長處，CPSEM的最大吸收峰在275 nm波長處，BSA和CPSEM偶聯(lián)后，主峰位移至285 nm波長處，出現(xiàn)紫外疊加，表明偶聯(lián)成功。根據(jù)朗伯-比爾定律，計算出CPSEM-BSA的分子結合比為11.8∶1。同理，計算出CPSEM-OVA的分子結合比為21∶1。

2.1.2 SDS-PAGE法鑒定

由圖4可知，BSA條帶約在68 kDa處，CPSEM-BSA與BSA的電泳速率稍有差異，CPSEM-BSA的條帶滯后，說明其分子質量較BSA有所增加，推斷是BSA連接了CPSEM所致，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件計算的偶聯(lián)比和紫外掃描結果一致。

2.1.3 效價測定

通過間接酶聯(lián)免疫吸附法測定小鼠血清效價，針對抗體和抗原特異性結合情況判斷免疫是否成功。

由表1可知，人工合成的SEM抗原免疫小鼠后，效價最高達1∶512 000，特異性良好。

2.2 NC膜封閉條件的優(yōu)化結果

封閉液目的在于封閉多余的結合位點，阻斷金標抗體在NC膜上的非特異性結合，保持背景的干凈，突出檢測線的顏色[25-26]。由表2可知，采用封閉液1封閉后，顯色明顯，且無背景顏色，說明封閉液1封閉效果很好。采用封閉液3封閉后，得到的檢測線顏色雖然很深、很明顯，但增加了一定的背景顏色，降低了檢測線相對于背景的反差。封閉液4和5的背景顏色淺，但是檢測線顏色淺，顯色效果不明顯。因此，選擇封閉液1進行封閉。

2.3 SEM熒光免疫層析試紙條的性能測試結果

2.3.1 標準曲線的建立

標準曲線方程為y=-1.444 5x+1.485 5（R?=0.992 9），線性關系良好。測定20 份空白魚肉組織樣品的平均值為0.154 μg/L，標準差為0.031 μg/L，魚肉組織的檢測限為0.247 μg/L。