QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定畜禽肉中11 種喹諾酮類獸藥殘留

黃坤 吳婉琴 羅彤 付文雯 范小龍 馬弋 王會霞

摘 要：建立一種超高效液相色譜-串聯質譜法測定畜禽肉中恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、氟羅沙星和達氟沙星共11 種喹諾酮類獸藥殘留的檢測方法。畜禽肉樣品經2%甲酸-乙腈均質提取，離心沉淀后上清液經QuEChERS凈化劑凈化后，經快速溶劑蒸發系統濃縮，采用Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分離，以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈為流動相進行梯度洗脫，電噴霧離子源電離，多反應監測模式采集信號，內標法定量。結果表明：11 種喹諾酮類獸藥在2～80 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好（R2>0.99），方法的檢出限和定量限分別為0.5～2.0 μg/kg和1.5～6.0 μg/kg;空白樣品加標量為10、25、50 μg/kg 3 個水平時，11 種喹諾酮類獸藥的平均加標回收率為74.52%～106.83%，相對標準偏差為1.8%～8.7%（n=6）。該方法檢測過程簡單快捷、準確度好、靈敏度高，適用于畜禽肉中喹諾酮類獸藥殘留的檢測。

關鍵詞：QuEChERS;超高效液相色譜-串聯質譜法;畜禽肉;喹諾酮類獸藥殘留

Abstract： A method for simultaneous determination of enrofloxacin， ciprofloxacin， ofloxacin， pefloxacin， norfloxacin， lomefloxacin， sarafloxacin， difloxacin， sparfloxacin， flerofloxacin and danofloxacin residues in livestock and poultry meat by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was established. Samples were homogenized and extracted with 2% formic acid-acetonitrile. After centrifugation， the supernatant was purified by the QuEChERS procedure， concentrated by a rapid solvent evaporation system， separated on a Waters BEH C18 column?（2.1 mm × 50 mm， 1.7 μm） with a mobile phase consisting of 0.1% formic acid-water and 0.1% formic acid-acetonitrile by gradient elution， detected in the multiple reaction monitoring （MRM） mode using an electrospray ionization source （ESI+） and quantified by an internal standard method. The results showed that good linearity was observed for all analytes in the concentration range of 2.0–80.0 ng/mL with correlation coefficients greater than 0.99 and the detection and quantitation limits were respectively 0.5–2.0 and 1.5–6.0 μg/kg. The average recoveries of blank samples spiked at 10， 25 and?50 μg/kg were 74.52%–106.83%， with relative standard deviation （RSD） values of 1.8%–8.7%（n = 6）. This method proved to be simple， accurate， highly sensitive and suitable for the simultaneous determination of quinolone residues in livestock and poultry meat.

Keywords： QuEChERS; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; livestock and poultry meat; quinolone residuesDOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190210-025

中圖分類號：TS251.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）03-0040-06

引文格式：

黃坤， 吳婉琴， 羅彤， 等. QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定畜禽肉中11 種喹諾酮類獸藥殘留[J]. 肉類研究， 2019， 33（3）： 40-45. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190210-025.? ? http：//www.rlyj.net.cn

HUANG Kun， WU Wanqin， LUO Tong， et al. Simultaneous determination of 11 quinolone residues in livestock and poultry meat by QuEChERS and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2019， 33（3）： 40-45. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190210-025.? ? http：//www.rlyj.net.cn

由于養殖業的快速發展和生態環境的惡化，導致各種動物疾病頻發，大量獸藥開始應用于預防和治療，從而可能蓄積于動物組織形成藥物殘留[1-2]，通過食物鏈進入人體內，對人體健康和生命安全產生不良影響[3-5]。喹諾酮類獸藥作為一類人工合成的廣譜性抗菌類抗生素，由于其吸收效果好、毒性較低而被廣泛應用于各種動物[6-7]。歐盟、聯合國糧農組織等均已指定多種喹諾酮類獸藥的最高殘留限量[8]，我國農業部發布的相關公告也對喹諾酮類獸藥的使用做出了明確規定。

目前，動物性食品中喹諾酮類獸藥殘留的檢測方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法（研究對象為畜禽肉[9-11]和水產品[12-13]）和高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法（研究對象分別為畜禽肉[14-16]、畜副產品[17]、禽蛋[18]和牛乳[19]等），但由于存在復雜基質干擾、前處理過程復雜、固相萃取耗時及回收率較低等問題，目前液相色譜法的應用受到限制。而QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）是一種快速、簡單、廉價、高效、可靠和安全的分散固相萃取技術，目前已廣泛應用于食品中獸藥殘留[20-22]和農藥殘留檢測[23-25]，但是將該樣品前處理方法運用于檢測畜禽肉中喹諾酮類獸藥殘留的方法不多。針對以上問題，本研究建立了一種QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測定畜禽肉中11 種喹諾酮類獸藥殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

畜禽肉樣品為本實驗室日常抽檢樣品。恩諾沙星（純度99.9%）、鹽酸環丙沙星（純度94.0%）、氧氟沙星（純度99.3%）、甲磺酸二水培氟沙星（純度99.0%）、諾氟沙星（純度99.1%）、鹽酸洛美沙星（純度98.7%）、鹽酸沙拉沙星（純度91.2%）、甲磺酸雙氟沙星（純度98.2%）、司帕沙星（純度99.3%）、氟羅沙星（純度99.5%）、甲磺酸達氟沙星（純度99.0%）、氘代恩諾沙星、氘代環丙沙星及氘代諾氟沙星，共14 種固體標準品 德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈、甲酸（均為色譜級） 美國Thermo Fisher Scientific公司;超純水 自制。

1.2 儀器與設備

XEVO TQ-S超高效液相色譜-串聯質譜儀 美國Waters公司;ME2002E、XS204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;Talboys數顯型渦旋混合器 美國Troemner公司;Allegra X-15R離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;RKTS-23050快速溶劑蒸發儀 英國Genevac公司;QuEChERS凈化劑（含有乙二胺-N-丙基硅烷、C18、無水硫酸鎂的混合填料，混合質量比1∶2∶50） 實驗室自配。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取適量的恩諾沙星、鹽酸環丙沙星、氧氟沙星、甲磺酸二水培氟沙星、諾氟沙星、鹽酸洛美沙星、鹽酸沙拉沙星、甲磺酸雙氟沙星、司帕沙星、氟羅沙星和甲磺酸達氟沙星標準品，用乙腈配制成質量濃度100 μg/mL的單一標準儲備溶液，必要時可加入少量甲酸超聲助溶。將以上各標準儲備溶液用0.1%的甲酸水溶液稀釋，配制成各標準品質量濃度均為1 μg/mL的混合標準儲備溶液。準確稱取適量的氘代恩諾沙星、氘代環丙沙星、氘代諾氟沙星標準品，用乙腈配制成質量濃度500 μg/mL的單一內標儲備溶液，然后用0.1%的甲酸水溶液稀釋，配制成各標準品質量濃度均為1 μg/mL的混合內標儲備溶液。分別準確移取混合標準儲備溶液（1 μg/mL）20、50、100、200、300、500、800 μL和200 μL混合內標儲備溶液（1 μg/mL）于10 mL容量瓶中，加入初始比例的流動相稀釋并定容，即得內標質量濃度為20 ng/mL的2、5、10、20、30、50、80 ng/mL系列混合標準工作溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

準確稱取試樣5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入40 μL混合內標儲備溶液和15 mL 2%甲酸-乙腈，渦旋分散后均質提取5 min，以10 000 r/min離心5 min;取全部上清液，向其中加入QuEChERS凈化劑5 g，渦旋混勻2 min，以4 000 r/min離心5 min，上清液于45 ℃條件下快速溶劑蒸發至近干，加入初始比例的流動相定容至2 mL，然后過0.22 μm微孔濾膜待分析。

1.3.3 色譜及質譜條件

1.3.3.1 色譜條件

超高效液相色譜儀：Waters Acquity UPLC，色譜柱：Waters BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫40 ℃，樣品池溫度15 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量2 μL。流動相及梯度洗脫條件如表1所示。

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜參數的選擇

2.1.1 色譜參數的選擇

分別考察乙腈-水、乙腈-0.1%三乙胺和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動相的效果，進行樣品測定。結果表明，采用乙腈-0.1%三乙胺流動相體系時，信號響應值較低，而采用乙腈-水流動相體系時，峰型欠佳，綜合分離效果、響應強度及穩定性考慮，最終選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動相進行洗脫，喹諾酮類獸藥的峰型對稱，保留時間適宜。

2.1.2 質譜參數的選擇

200 ng/mL的3 種氘代喹諾酮類內標混合標準溶液，進行一級質譜掃描，確定較為合適的母離子掃描條件;再對母離子進行二級掃描，篩選信號最強的離子對作為定量離子，信號次強的離子對作為定性離子對。得到多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）條件，包括定量及定性離子對、錐孔電壓和碰撞能量，詳見表2。在優化的色譜和質譜條件下，11 種喹諾酮類獸藥標準溶液（質量濃度80 ng/mL）的總離子流圖如圖1所示。

2.2 樣品前處理條件的選擇

目前，對于喹諾酮類獸藥殘留的測定，現行國家標準分別采用酸化乙腈[26]和EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH=4.0）[27]，有研究表明，酸化乙腈的提取液未凈化會導致較強的基質效應，而EDTA-Mcllvaine緩沖液由于提取液渾濁而導致固相萃取小柱堵塞，2 種提取方式均存在不足[28]。本研究選擇QuEChERS凈化劑對提取液進行凈化，可以較好地對提取液進行除雜處理，同時解決了過柱處理的繁瑣和耗時。考慮到乙腈具有沉淀蛋白的作用，而喹諾酮類獸藥在中性偏酸的環境中具有較好的穩定性[29]，故本研究采用2%甲酸-乙腈作為提取溶劑，對畜禽肉中的喹諾酮類獸藥殘留進行提取。

2.3 方法的線性范圍和檢出限的系列混合標準工作溶液，按照所確定的色譜和質譜條件進行檢測。其中恩諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星以氘代恩諾沙星為內標，環丙沙星、洛美沙星、雙氟沙星、達氟沙星以氘代環丙沙星為內標，諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、氟羅沙星以氘代諾氟沙星為內標，以標準物質質量濃度與內標質量濃度的比值ρx/ρ0對標準物質定量離子峰面積與內標定量離子峰面積的比值Ax/A0繪制標準曲線。

由表3可知，11 種喹諾酮類獸藥在2～80 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，R2均大于0.99，以信噪比RS/N=3結合實際基質噪音情況確定方法的檢出限為0.5～2.0 μg/kg，以RS/N=10確定方法的定量限為1.5～6.0 μg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度

為了驗證本方法測定畜禽肉中11 種喹諾酮類獸藥殘留的可行性和準確性，采用空白豬肉和雞肉基質樣品（已檢測過的陰性樣品）進行加標回收率驗證，加標水平分別為10、25、50 μg/kg，按照前述方法處理，每個水平重復6 次實驗，計算平均回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

由表4～5可知，空白豬肉和雞肉基質樣品中11 種喹諾酮類獸藥的平均回收率為74.52%～106.83%，RSD為1.8%～8.7%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[30]中對方法回收率的要求。

2.5 實際樣品的測定

按本研究所建立的方法，對實驗室抽檢的一批50 份畜禽肉中的喹諾酮類獸藥殘留進行檢測，測得其中2 份雞肉不合格，分別含恩諾沙星（以恩諾沙星與環丙沙星之和計）781 μg/kg和氧氟沙星17.4 μg/kg，說明相關養殖行業存在喹諾酮類獸藥濫用的現狀，亟需對此類風險進行管控。同時采用現行國標GB/T 21312—2007《動物源性食品中14 種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》對2 份不合格樣品進行復測，結果均無明顯差異。比對實驗表明，在保證測定結果準確性的前提下，本研究所建立的方法與現行國標相比在簡化實驗流程上有一定優勢。

3 結 論

本研究建立了一種同時測定畜禽肉中11 種喹諾酮類獸藥殘留的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法，該方法分析過程簡單、快速、回收率好、靈敏度高，滿足對畜禽肉中喹諾酮類獸藥殘留測定的相關要求，能夠為畜禽肉及相關農產品的安全監測與評估提供技術依據。

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