吡格列酮對糖尿病大鼠腎臟組織中干細胞標志物表達的影響*

張業， 嚴瑞,2， 李華， 劉暢， 周興艷， 朱春玲,2**

(1.貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學附院 腎內科， 貴州 貴陽 550004)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病最常見的并發癥，可引起進行性腎臟纖維化，最終發展為終末期腎病[1-2]。上皮細胞向間質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是促使多種器官纖維化發生的重要進程，使正常組織及腫瘤組織中產生具有干細胞特性的細胞[3]。已有研究表明，成年人腎含有腎臟干(祖)細胞(kidney stem cell)，這些細胞既可表達小管細胞標記物，又可表達足細胞標記物[4]。近來對噻唑烷酮類化合物(thiazolidinediones，TZDs)吡格列酮(pioglitazone)及其受體 PPAR-γ 的研究表明，TZDs 可通過減輕胰島素抵抗、改善糖脂代謝及一些獨立于降糖外的作用直接減輕腎臟疾病[5]。因此，本研究以糖尿病大鼠(DM)為研究對象，觀察腎組織中干細胞標志物及腎臟纖維化指標的表達變化，同時觀察吡格列酮是否會影響上述指標的表達水平，為吡格列酮治療DN提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

SPF 級SD大鼠(雄性)，體質量(185±15)g(購自華阜生物有限公司，許可證號SCXK(京)2009-0004)，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天生物公司)，預染Marker(Thermo Scientific公司)、rabbit-anti-β-actin ( 巴傲得生物科技有限公司)、rabbit-anti-CD24(Proteintech公司) 、rabbit-anti-CD133(abcam公司)、rabbit-anti-Fibronectin、rabbit-anti-E-cadherin、rabbit-anti-α-SMA(Proteintech公司)，總RNA提取試劑盒(天根生化科技公司)，引物合成(上海生工公司)，real-time PCR試劑盒(Takara公司)

1.2 方法

1.2.1動物模型建立及實驗分組 SD大鼠共24只，隨機均分為正常組(NC組)、糖尿病組(DM組)及吡格列酮治療組(DP組)。DM及DP組大鼠禁食(不禁水)12 h后，將1%STZ按照55 mg/kg腹腔注射，72 h后通過其尾靜脈檢測血糖，當血糖≥16.7 mmol/L提示達到成模標準。NC組給予同等體積的檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。DP組模型大鼠飼養3周后，給予吡格列酮10 mg/(kg·d) 灌胃治療8周，每周休息1 d；NC、DM組予同等量的生理鹽水灌胃。3組大鼠飼養至16周時，大鼠禁食(不禁水)12 h，麻醉后取股動脈血，4 ℃離心后分離出血清，測定血清葡萄糖含量；之后處死大鼠，解剖、摘除雙側腎臟用于后續檢測。

1.2.2腎組織CD24、CD133、E-cadherin、α-SMA及Fibronectin蛋白測定 取大鼠腎組織皮質部分，加入蛋白裂解液研磨后提取出總蛋白，蛋白濃度通過BCA法測定。將各組蛋白質樣品加至SDS-PAGE凝膠中，經電泳、轉膜、5%脫脂牛奶封閉后，用CD24、CD133、E-cadherin、α-SMA、FN及 β-actin 對應的一抗(分別按照1∶800、1∶600、1∶1 000、1∶600、1∶1 000 及1∶6 000稀釋)孵育轉有蛋白的PVDF膜，將其放置于搖床上，并在4 ℃冰箱中輕度搖晃過夜；TBST洗膜3次后，加入Goat Anti-Rabbit二抗稀釋液(1∶6 000)后在室溫中孵育1 h；再次用TBST洗膜3次，ECL 顯色，最后曝光成像。實驗結果用 Imaje J 軟件檢測出不同分組、不同蛋白所得條帶的灰度值，以β-actin的灰度值作為內參，得出目的蛋白的相對含量。

1.2.3腎組織中CD24和CD133 mRNA測定 應用Trizol法提取大鼠腎組織的總RNA并測定其濃度，步驟參照北京天根公司提供說明書；選取20 μL作為反轉錄的反應體系合成模板cDNA，應用上海生工公司提供的PCR引物，采用SYBR premix Ex TaqII進行熒光定量PCR。目的基因引物序列見表1。

1.3 統計學方法

表1 目的基因引物序列Tab.1 Primer sequence in real time RT-PCR

2 結果

2.1 腎組織中的CD24和CD133mRNA表達

與NC組比較，DM組大鼠腎組織CD24、CD133 mRNA表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)，DP組差異無統計學意義(P>0.05)。與DM組比較，DP組兩種mRNA表達顯著減少(P<0.05)。見圖1。

(1)與NC組比較，P<0.05； (2)與DM組比較, P<0.05圖1 各組大鼠腎組織CD24和CD133 mRNA表達Fig.1 Expression of CD24 mRNA and CD133 mRNA in kidney tissue in each group

2.2 CD24和CD133蛋白表達

與NC組比較，DM組大鼠腎組織CD24、CD133蛋白表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)，DP組差異無統計學意義(P>0.05)。與DM組比較，DP組大鼠腎組織兩種蛋白表達均減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DM組比較, P<0.05圖2 各組大鼠腎組織CD24和CD133蛋白表達Fig.2 The protein expression of CD24 and CD133 in renal tissues in each group

2.3 腎組織中E-cadherin、α-SMA及Fibronectin蛋白表達

與NC組比較，DM組大鼠腎組織Fibronectin、α-SMA蛋白表達增多，E-cadherin表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)，DP組差異無統計學意義(P>0.05)。與DM組比較，DP組大鼠腎組織Fibronectin、α-SMA蛋白表達減少，E-cadherin表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

3 討論

糖尿病腎病的病理發展包括腎小球硬化和腎小管間質的纖維化。在促纖維化因子及炎性因子作用下可發生腎小管EMT[6]，并引起細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)的過度沉積。纖維蛋白是細胞外基質的框架，主要包括膠原蛋白(collagen)、纖連蛋白(fibronectin)和彈性蛋白(elastin)，它們可作為預測ECM沉積的因子[7]。有研究證實[4，8]，成年人腎臟組織中存在干/祖細胞區室，如Bowman’ s 囊中的CD24+CD133+細胞。在不同的急性腎損傷(AKI)小鼠模型中都證實了此類細胞在腎臟修復中的作用：輸注后可以降低小鼠的死亡率，改善腎功能[9]。在阿奇霉素所致慢性腎損傷小鼠模型中證實，上述細胞可產生新的腎小管上皮細胞及足細胞，并且在急性或慢性腎臟損傷的患者腎臟組織中發現CD24+CD133+細胞增殖活躍[10]。但目前對腎臟干細胞的研究大多集中在對胚胎腎、急性腎損傷模型及外源性干細胞治療方式，在成體及慢性腎損傷中是否存在干細胞仍有爭議[11]。Kusaba[12]通過對細胞損傷和修復的克隆分析認為，干細胞標記物的產生是由于終末分化的上皮細胞在損傷后發生了去分化，使其在間充質狀態期間發生了再表達，而不是干細胞群的功能體現。CD24、CD133可表達于多種細胞，并作為多數器官和腫瘤組織中干/祖細胞的表面抗原標志物[13]。

(1)與NC組比較，P<0.05； (2)與DM組比較, P<0.05圖3 各組大鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA及Fibronectin的表達Fig.3 The protein expression of E-cadherin、α-SMA and Fibronectin in kidney tissues in each group

EMT 分為1 型參與胚胎形成及器官發育，2 型參與組織再生與創傷、炎癥后的修復和3 型參與腫瘤相關疾病3種類型[14]。有研究證實，在肺組織[15]、乳腺組織[16]及皮膚組織[16]中，EMT的發生可誘導細胞獲得干性特征，使已分化的細胞表現出類似干/祖細胞增殖克隆和自我更新的特性，但它們的增殖種類與分化方向不定[17]。在EMT發生過程中，具有上皮表型特征的E-鈣黏蛋白(E- cadherin)可表達下調，具有成纖維表型特征的α-平滑肌肌動蛋白(α- SMA)可上調[18]。 大量研究證實，在STZ誘導的糖尿病鼠中，噻唑烷二酮類藥物可通過調節糖代謝、脂代謝對腎臟產生間接保護作用[19]；還可通過直接保護腎臟血管內皮細胞及減輕足細胞損傷，抑制腎臟系膜的增生，防止腎小球硬化，抑制腎小管的間質纖維化[20]。而在DM大鼠中，吡格列酮是否可通過抑制EMT的進程，減輕腎臟纖維化，并影響腎臟干細胞標志物的表達目前尚不清楚。

因此，為了探討吡格列酮對腎臟中干細胞標志物表達的影響，本研究采用腹腔注射STZ的方法復制大鼠DN模型，用Westernblot、Real-time PCR的方法檢測CD24、CD133、E-cadherin、α-SMA、Fibronectin蛋白及CD24、CD133mRNA的表達變化。實驗發現，DM大鼠腎組織中腎臟纖維化標志物Fibronectin蛋白表達增加，腎小管上皮細胞表型標志物E-cadherin蛋白減少而纖維細胞標志物α-SMA蛋白大量表達，與之伴隨的是CD24、CD133蛋白及mRNA表達上調；而在DP大鼠腎組織中發現Fibronectin、α-SMA蛋白、CD24、CD133蛋白及mRNA表達均下降，E-cadherin蛋白表達增多。因此，本實驗認為CD24、CD133參與了腎臟纖維化的進程。由此猜測，在糖尿病大鼠腎組織中，EMT的發生可誘導已分化的上皮細胞轉分化至間充質細胞，這類細胞獲得了擴增和遷移等干細胞特征，并且可表達干細胞標志物，它們可能分化成了肌成纖維細胞，分泌細胞外基質，導致腎臟纖維化的發生。同時，成體腎臟干細胞只有在腎臟發揮修復作用時才可由靜止狀態轉向增殖狀態[21]。Lasagni等[22]發現，在局灶性腎小球硬化癥的小鼠模型中，阻斷 Notch 通路可減輕腎小球損傷，但會引起干細胞的增殖減少。隨著糖尿病腎病的進展，可能使CD24+CD133+細胞等腎臟干細胞的激活，這類細胞在體內發生了增殖與分化，一定程度上參與修復腎臟固有細胞的損傷，最終大鼠腎臟纖維化的程度可能取決于腎臟固有細胞的死亡與腎臟干/祖細胞的再生之間的平衡。而吡格列酮可能通過抑制EMT進程，使具有干性特征的間充質細胞及其分化的肌成纖維細胞減少，從而減輕了腎臟纖維化程度，同時也使腎臟干細胞的增殖減少。

綜上，在DN條件下，大鼠腎組織中干細胞標志物CD24、CD133的表達變化可能與EMT有關，同時證實了吡格列酮可抑制EMT、減輕腎臟纖維化并影響腎臟干細胞標物的表達水平。今后，將通過體外實驗及基因干預的方法，從而較為全面、直接地研究腎臟干細胞的作用及吡格列酮在其中發揮的作用。