小鼠FGF21基因克隆及his-mFGF21融合蛋白的誘導表達*

唐青藍， 李紅梅， 張禮林， 王玉豐， 顏禮完， 周君

(1.海南省第三人民醫院 檢驗科， 海南 三亞 572000； 2.貴州醫科大學 生物化學與分子生物學教研室， 貴州 貴陽 550004)

成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)作為FGF超家族的重要成員之一，是具有多效應的內分泌性生長因子。FGF21可以降低血糖、調節糖脂代謝[1]，但具體作用機制仍未明確。近期研究顯示，FGF21在腎臟疾病、高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化、糖尿病心肌病、缺血或肥厚引起的多種心肌疾病中有重要作用[2-6]。FGF21作為一個重要物質代謝調節因子，不僅有明顯的改善高血脂、高血糖和肥胖的作用，也能緩解動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病病情，亦可能直接參與疾病進程，是相關疾病預測、治療因子[7]。本課題組前期研究發現動脈粥樣硬化患者FGF21水平明顯高于正常對照，且與氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)呈正相關[8]。但目前，FGF21在心血管疾病中具體作用機制尚未研究清楚，仍是研究熱點。因此，本研究擬將小鼠FGF21 基因進行克隆，將重組子pET-28a(+)-mFGF21進行誘導表達，并純化出小鼠FGF21 融合蛋白，為進一步開展對FGF21作用機制的研究提供基礎條件。

1 材料與方法

1.1 材料

pMD19-T-M重組質粒、大腸桿菌菌株BL21(DE3)、質粒pET-28a(+)、小鼠FGF21上下游引物由本實驗室保存并提供，限制性核酸內切酶、Premix Taq試劑盒、T4 DNA 連接酶、瓊脂糖凝膠-DNA純化試劑盒、X-gal及IPTG購自寶生物工程有限公司，質粒DNA提取試劑盒購自OMEGA公司，咪唑、PMSF、Triton X-100、TRIS，HIS-Select Nickel Affinity Gel 購自sigma-aldrich公司，FGF-21 Antibody rabbit polyclonal IgG、Goat anti-rabbit IgG-HRP購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠FGF21基因克隆及pET-28a(+)-mFGF21原核表達載體的構建 以本實驗室前期構建-20 ℃保存的帶有小鼠FGF21的T載體pMD19-T-M溶液作為模板擴增小鼠FGF21基因片段，上游引物中帶有BamHI酶切位點和2個保護性堿基，下游引物中帶有XhoI酶切位點和2個保護性堿基；上游引物序列為5′-CGGGATCCGCATACCCCATCCCTGACT-3′，下游引物序列為5′-CCCTCGAGGGACGCATAGCTGGGGCT-3′，下劃線分別為BamHI及XhoI酶切位點。擴增程序：94 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min)×30個循環，72 ℃ 10 min。將擴增產物進行電泳、割膠回收處理、BamHI和XhoI雙酶切，再將其連接至雙酶切處理的pET-28a(+)質粒上，獲得pET-28a(+)-mFGF21表達載體，將其轉化至Ecoli.BL21DE3感受態細胞。選擇抗生素平板篩選出的單菌落(陽性轉化子)進行過夜培養，提取質粒DNA用BamHI和XhoI進行雙酶切后電泳檢測、并送基因公司測序鑒定正確，pET28a(+)-mFGF21表達載體構建成功。

1.2.2融合蛋白his-mFGF21的原核表達 將篩選出的單個陽性克隆菌落放在50 mL含抗生素的LB液體培養基中，水浴箱中37 ℃ 180 r/min振蕩培養24 h，再取0.2 μL菌液至含抗生素的LB液體培養基中振搖至 OD600=0.4，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，水浴箱中23 ℃ 120 r/min振蕩培養4 h，收集1 mL菌液處理，SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白表達。

1.2.3融合蛋白his-mFGF21的純化 留取100 mL體系誘導表達的菌體沉淀，以8 mL裂解液重懸菌體后加入 PMSF(0.1 mol/L)，輕柔吹打，振蕩20 min，超聲破碎1 h(冰浴條件下進行)，4 ℃條件下將破碎后的菌液12 000 r/min 離心20 min后收集上清。取少量超聲破碎的上清與超聲破碎的菌體沉淀進行SDS-PAGE電泳鑒定。將200 μL超聲破碎后上清液加入400 μL平衡緩沖液(不含咪唑)，顛倒混勻(輕柔)數次，離心棄上清，留樣少許。1 mL預冷的清洗緩沖液(不含咪唑)清洗親和凝膠(輕柔混合)，離心棄上清并留樣，重復此步驟3次。將清洗好的親和凝膠與100 μL his洗脫緩沖液結合，旋轉(輕柔)混勻1 min，離心后取上清留樣，重復此步驟2次。對純化后的蛋白液、留樣保存的漂洗液以及洗脫緩沖液采用 SDS-PAGE電泳進行鑒定。

1.2.4Western Blot檢測 取純化后的his-mFGF21蛋白液先后進行SDS-PAGE凝膠電泳、蛋白條帶轉膜(至PVDF膜上)、封閉、一抗結合(兔源性FGF21多克隆一抗)、二抗結合(羊抗兔)、顯色(ECL-Plus發光試劑)。

2 結果

2.1 小鼠FGF21基因克隆及pET-28a(+)-mFGF21原核表達載體的構建

將BamHI和XhoI雙酶切的小鼠FGF21基因(大體系擴增回收)克隆至同樣用BamHI和XhoI雙酶切處理的pET-28a(+)質粒中，獲得pET-28a(+)-mFGF21表達載體，將其轉化至Ecoli.BL21DE3感受態細胞，于抗生素平板上篩選出陽性克隆(如圖1)，初步表明pET-28a(+)-mFGF21表達載體構建成功。篩選出的陽性克隆的菌落培養24 h后提取質粒，進行BamHI和XhoI雙酶切，可見2條條帶(如圖2)，與pET-28a(+)和小鼠FGF21(546 bp)位置一致。雙酶切電泳顯示正確的質粒DNA送上海生工生物科技公司測序鑒定，結果表明重組質粒pET-28a(+)-mFGF21 雙向測序結果正確，與小鼠FGF21基因序列相符。

圖1 pET-28a(+)-mFGF21原核表達載體篩選平板Fig.1 Plate screening of pET-28a(+)-mFGF21 prokaryotic expression vector

注：M1為100 bp DNA階梯marker，M2為wide range 1 000 bp DNA階梯marker；1、2為pET-28a(+)-mFGF21的雙酶切產物圖2 pET-28a(+)-mFGF21原核表達載體酶切分析Fig.2 The restriction endonuclease digestion analysis of pET-28a(+)-mFGF21 prokaryotic expression vector

2.2 融合蛋白his-mFGF21的原核表達

SDS-PAGE電泳顯示在22 kD處出現明顯目的蛋白條帶，證明his-mFGF21誘導表達成功，見圖3。

注：M為蛋白marker，1為BL21(DE3)菌株誘導表達作為陰性對照，2為pET-28a(+)-mFGF21的BL21DE3菌株未誘導，3、4為pET-28a(+)-mFGF21的BL21DE3菌株在0.2 mmol/L 濃度的IPTG誘導表達的蛋白產物圖3 his-mFGF21融合蛋白誘導表達產物Fig.3 Induced expression product of his-mFGF21 fusion protein

2.3 融合蛋白his-mFGF21的純化

取少量超聲破碎的上清與超聲破碎的菌體沉淀進行SDS-PAGE電泳，顯示在22 kD處出現明顯目的蛋白條帶(如圖4)，證明經超聲破碎菌體后的上清中存在大量融合蛋白his-mFGF21可溶性表達。對純化后的his-mFGF21蛋白液、留樣保存的漂洗液以及洗脫緩沖液采用 SDS-PAGE電泳，結果顯示在22 kD處均有明顯的目的蛋白(如圖5)，證明融合蛋白his-mFGF21純化成功。

注：M為蛋白marker，1、2分別為誘導表達后超聲破碎菌體后的上清液、沉淀液圖4 融合蛋白his-mFGF21的可溶性分析Fig.4 Soluble analysis of fusion protein his-mFGF21

注：M為蛋白marker，1為超聲破碎菌體的上清液結合凝膠離心后的蛋白溶液，2、3、4為融合蛋白溶液結合凝膠經第2次、第3次、第4次漂洗留取的漂洗液，5、6、7為第1次、第2次、第3次洗脫液洗脫的融合蛋白圖5 純化融合蛋白his-mFGF21檢測Fig.5 Analysis of purified fusion protein his-mFGF21

2.4 Western Blot檢測

取純化后的his-mFGF21蛋白液進行SDS-PAGE凝膠電泳，采用免疫印跡法進行分析，顯色后在22 kD左右有一特異性蛋白條帶，如圖6所示。

圖6 Western Blot檢測融合蛋白his-mFGF21Fig.6 Western Blot detection of fusion protein his-mFGF21

3 討論

近年來，動脈粥樣硬化發病率越來越高，已成為一種常見病，嚴重影響人類健康。大量證據表明，導致動脈粥樣硬化的重要危險因素有高血糖、高脂血癥、肥胖、高血壓、吸煙、代謝紊亂、高纖維蛋白原血癥、高半胱氨酸血癥及慢性應激等[9]。此外，糖代謝異常是動脈粥樣硬化的獨立危險因素，動脈粥樣硬化在T2DM 患者中的發生發展中與攝糖過多、胰島素抵抗等有關[10-11]。除了糖代謝異常，脂質代謝紊亂、內皮細胞功能受損以及炎性反應等在動脈粥樣硬化的病理過程中均起到很重要的作用[12]。

FGF21是2000年首次從小鼠胚胎組織中分離出來，小鼠FGF21由210個氨基酸組成，在多種組織中均有分布，主要表達在肝臟，少量表達在脂肪、性腺、骨骼肌、胰島細胞、心臟[2,13]。在FGF家族中，其經典的家族成員可以通過肝素錨定直接與成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptors，FGFRs)結合，對細胞的分化與增殖進行調節。不同的是，FGF21、FGF19和FGF23這一亞家族無肝素錨定位點。FGF21在發揮代謝調節作用時，必須有βKlotho的協助，激活FGFR1后，形成FGF21/βKlotho/FGFR復合體后，FGFR發生二聚化、自身磷酸化，在下游多種分子作用下激活多種信號通路，啟動Akt等多個信號系統共同發揮對代謝的調節作用[14]。研究發現，FGF21在不同狀態下，作用不一，(1)在健康狀態下發揮生理作用，不會對機體的正常代謝產生干擾；(2)在病理情況下發揮重要藥理作用，FGF21在代謝異常的小鼠體內會促進解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)、葡萄糖轉運蛋白1(glucose transporter protein 1,GLUT1)等的表達對糖、脂代謝進行調節；(3)當機體處于應激狀態時，FGF21具有抵抗多種細胞凋亡的作用(如肝細胞、胰島β細胞、心血管內皮細胞以及心肌細胞等)[15-18]。雖然FGF21在疾病初期發揮代償作用，但隨著疾病進展，特別是在代謝紊亂時可能有FGF21抵抗的存在，進而影響代謝綜合征的發展[14]。有研究者認為，FGF21可能通過抵抗炎癥反應、抗氧化應激作用、調節線粒體功能、調節熱休克蛋白表達、調節心肌能量代謝和拮抗心肌細胞凋亡等機制進一步影響動脈粥樣硬化等心血管疾病的發展過程[19-23]。

因FGF21是目前發現的FGFs家族中唯一無促有絲分裂活性作用的基因，當其作用于BalB/c 3T3、NIH 3T3和HMECS細胞后，均無促有絲分裂活性，故不存在致瘤的可能性，可以降低作為臨床潛在藥物的風險，因此具有活性的FGF21蛋白更是作為糖尿病的新型候選藥物而備受關注[24]。

綜上所述，FGF21 可能會成為糖尿病、代謝性疾病、心血管疾病以及腎臟疾病等的獨立預測因子、生物標志物和治療靶點[25-26]。本研究通過PCR 克隆將小鼠FGF21基因片段擴增后連接至pET-28a(+)，對其重組子pET-28a(+)-mFGF21進行原核表達，經親和層析后純化，采用Western Blot進行鑒定證明成功獲得了可溶性的小鼠FGF21的融合蛋白，且誘導表達效果理想。為進一步研究該融合蛋白的功能并應用于動脈粥樣硬化及相關疾病的治療作好了前期準備。