貴州黔南喀斯特洞穴放線菌抗菌活性篩選及差異研究*

牛雪可， 蘭永哲， 李文均， 曹煜， 黃勁， 廖萬清， 康穎倩*

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 微生物學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 貴州省微生物與人類健康關系研究人才基地暨貴州省普通高校病原生物學特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.中山大學 生命科學學院, 廣東 廣州 510275； 4.貴州醫科大學附院 皮膚科， 貴州 貴陽 550004； 5.第二軍醫大學上海長征醫院 真菌學研究所， 上海 200003)

在深海熱液口發現的、以化能無機營養生物為基礎的生態系統已顛覆了所有生命都依賴于光的理論[1]，喀斯特洞穴作為極端環境中一種特殊的生態系統，具有黑暗、對流交換緩慢、營養物質匱乏等特點，洞穴環境雖特殊但仍有大量生理功能特殊和耐受適應的生物存在，且多樣性豐富[2]。由于地理條件的限制，大多數洞穴未被探測或極難進入，因此受到外界環境干擾少，能夠較好的保持其原始性，洞穴內常生存著一些能夠耐受極端環境的微生物，且微生物還處于較為原始的抗藥性階段，可以在其中尋找天然的抗菌藥物。目前貴州省喀斯特地區放線菌研究主要集中在土壤放線菌生物多樣性[3-5]、喀斯特環境與微生物的相互作用方面，對天然喀斯特洞穴內放線菌生物多樣性及抗菌活性研究有限，而位于貴州荔波縣的茂蘭國家級喀斯特森林自然保護區，是我國中亞熱帶喀斯特地貌上原生性森林植被保存較完好的一塊寶地，本實驗從茂蘭喀斯特天然洞穴中采集樣本，對原生態微生物進行純培養，選擇真菌、細菌、放線菌中5種致病菌進行放線菌的抗菌活性研究，為貴州省放線菌的分類及資源開發提供研究資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1樣品 2018年8～9月于貴州省荔波市茂蘭喀斯特森林無名洞穴內采集，置于無菌紙袋中，運回實驗室4 ℃保存。

1.1.2培養基 發酵培養基1(AM3)：可溶性淀粉10 g, 大豆粉10 g, 甘油10 g,蛋白胨15 g,CaCO32 g。發酵培養基2(RA)：可溶性淀粉20 g,葡萄糖10 g,麥芽提取物10 g,麥芽糖 10 g,玉米粉5 g，微量元素100 U/L,CaCO32 g。發酵培養基3(ISP5)：葡萄糖10 g,酵母提取物4 g,麥芽提取物10 g。 純化培養基(TSA)：大豆蛋白胨5 g,胰蛋白胨15 g,NaCl 15 g，瓊脂 15 g。

1.1.3測試病原微生物 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、大腸埃希菌(Escherichiacoli)ATCC25922、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231、新生隱球菌(Cryptococcusneformans)H99、土地戈登氏菌(Gordoniaterrae)IFM 161，大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌為貴州醫科大學微生物學教研室保存菌株，其余均獲贈于日本千葉大學真菌研究所。

1.1.4主要試劑 TIANGEN?細菌基因組DNA提取試劑盒、Genstar?PCR MIX、國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1放線菌分離 將土壤樣本風干研磨后，使用無菌水制成10-2土壤懸液，取200 μL涂布于分離平板上，28 ℃培養7 d，觀察生長菌落的形態特征，挑取單菌落接種于TSA板進行純化，28 ℃培養4～5 d，直至獲得單一純菌。

1.2.2基因組DNA提取及16S rRNA擴增 采用細菌基因組DNA提取試劑盒制備DNA模板，采用16S rRNA通用引物[6]27f(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)1492r(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進行PCR擴增，反應體系及條件參照文獻 [7]。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送英淮捷基(上海)貿易有限公司進行序列測定。

1.2.316S rRNA 基因比對 將獲得的序列在CLUSTAL_X program進行比對后[8]，與現有的純培養序列在NCBI 數據庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)及EzTaxon-e 工具進行比對[9]。

1.2.4抗菌活性實驗 將篩選出的放線菌每株接種于AM3、RA、ISP5三種不同的培養基中，置于28 ℃搖床中發酵1周，10 000 r/min離心取上清,過0.22 μm濾膜，獲得發酵液。將病原菌活化后，制成菌懸液(0.5麥氏)，均勻涂布于無菌PDA/TAS平板上，使用管碟法[10]，于37 ℃正置培養24～48 h。十字交叉法記錄抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 分離到的放線菌

從茂蘭喀斯特洞穴樣品中共分到35株放線菌，歸屬于放線菌門下3個目5個科9個屬22個種，其中優勢菌屬為Rhodococcus屬(45.7%)，Arthrobacter屬(17.1%)。見表1。

表1 貴州荔波茂蘭喀斯特森林無名洞穴放線菌分離結果Tab.1 Actinomycetes isolation result in Kast caves

2.2 抗菌活性

35株放線菌中15株對至少一種病原菌具有抑制作用，占比42.8%，其中編號為K1028、K1006、K2049的菌株對白念珠菌有抑制作用，尤其K1028菌株抑制作用最強，屬于微桿菌屬；9株放線菌對新生隱球菌有抑制作用，其中K4211-2(巴氏桿菌)、K4213(厄氏菌屬)、K4239-2(鏈霉菌屬)表現出了極強的抑制作用；K4239-2(鏈霉菌屬)及K3102(鏈霉菌屬)、K4212-3(紅球菌屬)對戈登氏菌具有抑制作用；K3218-1、K417對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，K4213、K417、K3219、K2010對大腸埃希菌具有抑制作用。見表2。

表2 分離放線菌對5種病原菌抗菌活性Tab.2 Antibacteria activity of actinomycetes

續表

菌株編號發酵培養基Cryptococcus neformansCandida albicansGordonia terraeStaphylococcus aureusEscherichia coli1+----K4412----3++----1-++---K20492-----3-----1++----K20312++----3+----1-----K31022-----3--++--1-----K4172---+++++3----1----+++K32192-----3-----1-----K20102-----3----+++

注:+++表示抑菌圈直徑>25 mm， ++表示抑菌圈直徑15 mm～25 mm， +為抑菌圈直徑<15 mm， -表示無抑菌圈

2.3 不同培養基獲得抗菌活性的差異

在抗菌活性試驗中，同一菌株使用不同的培養基發酵，其代謝產物對同一病原菌的抗菌活性差異顯著。15株活性菌株中，在AM3培養基中具有抗菌活性的菌株有8株，占53.3%，ISP5培養基有抗菌活性菌株數量與AM3相同，RA培養基有抗菌活性菌株數量為5株，占比33.3%。見圖1、圖2。

注：A為E.coli，B為S.aureus，C為G.terrae，D為C.neformans，E為C.albicans圖1 放線菌在不同培養基發酵條件下的抑菌譜Fig.1 Antimicrobial spectrum of actinomycetes under different fermentation conditions

注：A為K1032菌株3號發酵液對Gordonia terrae的抑制作用，B為K441菌株3號發酵液對Cryptococcus neformans的抑制作用，C為K1028菌株2號發酵液對Candida albicans的抑制作用，D為K2049菌株1號發酵液對Candida albicans的抑制作用圖2 部分菌株在不同發酵培養條件下的抑菌情況Fig.2 Difference antimicrobial activity under different culture condition

3 討論

本研究首次對貴州茂蘭喀斯特森林內的洞穴進行了放線菌類群的分離鑒定及抗菌活性篩選研究，選擇使用了3種不同的發酵培養基(RA、ISP5、AM3)對放線菌產生抗菌活性差異的影響因素進行了比較和探討。共分離獲得35株可培養放線菌，其中棒桿菌目和微球菌目所占比例各半，優勢菌屬為紅球菌屬(45.7%)、其次為節桿菌屬(17.1%)，另有少量的鏈霉菌屬，而湖北、云南、河南等地洞穴放線菌優勢菌屬為鏈霉菌屬[11-13]，表明微生物群落多樣性存在地域性差異。在分離到的放線菌中42.8%的菌株表現出了抗菌活性，尤其是對病原真菌有較強的抑制作用?？拐婢股氐陌l展一直較抗細菌抗生素緩慢[14]。近年來，隨著 HIV 感染的蔓延、免疫抑制劑的廣泛使用、免疫功能低下患者的增加、人口的老齡化、器官移植等醫療技術的發展以及留置醫療器械的廣泛使用等，導致侵襲性真菌感染的發病率及耐藥率逐漸升高[15-16]。侵襲性真菌感染不僅能造成皮膚、黏膜的淺表感染，還能造成免疫功能低下患者致命的系統感染。有學者從肺癌、艾滋病、慢性粒細胞白血病等樣本中分離出大量念珠菌[17-18]，成為醫院感染排名第四位的病原菌[19]，也是導致血液、腫瘤和 ICU 病房患者最主要的死亡原因之一，致死率達到 40%～60%[20]。白念珠菌感染的日益流行及其較高的致死率一直都是人們關注的。本研究發現了多株對念珠菌及隱球菌具有抑制作用的活性菌株，研究結果有助于天然、高效、廣譜、抗真菌抗生素的開發，具有巨大的利用價值。

本次研究使用的3種發酵培養基，碳氮源的成分的差異影響了放線菌抗菌活性。碳源和氮源是影響微生物代謝的重要因素，從AM3及ISP5培養基發酵產物中獲得具有抗性菌株的比例高于RA培養基。考慮單因素影響，促進放線菌抗菌活性物質產生的最佳碳源為玉米粉其次為可溶性淀粉及葡萄糖，最佳氮源為蛋白胨其次為黃豆粉酵母粉[21-24]。本次洞穴中分離到的放線菌在使用葡萄糖作為碳源或麥芽提取物作為氮源的培養基發酵時，產生具有抗菌活性的物質量少或無抗菌活性的物質產生，一方面提示麥芽提取物并非理想的洞穴放線菌活性物質產生的營養因子，另一方面說明淀粉作為碳源有利于發酵液中活性物質的產生和代謝[25]，培養基的碳氮源差異最終導致分離到的放線菌的代謝譜變化，使抑菌活性更強或失去了抑菌活性。因此在進行洞穴放線菌活性篩選時，可以選擇黃豆粉、酵母粉等復合氮源，其中不僅含糖，氮素和灰分，還含有促進放線菌生成及孢子萌發的生長因素，可以促進新的天然活性產物的發現[26]。

綜上所述，本研究對黔南喀斯特洞穴極端環境的放線菌資源進行了初步調查，分離得到了具有潛在開發利用價值的放線菌資源，對當地放線菌微生物資源的開發和保護有重要的意義。