阿爾茨海默病患者不同腦區SOD-2與SIRT3的表達水平及相關性*

向潔， 曹坤， 董陽婷， 曾曉曉， 徐毅， 冉龍艷， 鄧婕， 官志忠,**

(1．貴州醫科大學附院 病理科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學 貴州省醫學分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

阿爾茲海默病(alzheimer’s disease,AD)又稱老年性癡呆，是一種主要在老年期發生的神經元退行性變疾病，以進行性癡呆為主要特征，主要神經病理學改變有老年斑增多、神經元纖維纏結形成、神經元喪失及腦萎縮[1]。近年來隨著以清除Aβ為主流的臨床III期治療藥物研究的失敗，進一步闡明AD的分子發生機制、分析臨床研究失敗的原因、以及采取新的治療途徑等成為當前AD研究的熱點[2]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，可分為銅-鋅-SOD(Cu-Zn-SOD，SOD-1)、錳-SOD(Mn-SOD，SOD-2)和鐵-SOD(Fe-SOD，SOD-3)三種。其中，SOD-2是線粒體內重要的抗氧化物酶，可將超氧化物分解為水和過氧化氫，從而保護細胞免受氧化損傷。沉默信息調節因子-3(silent information regulator 3，SIRT3)是一種依賴NAD+的去乙酰化酶，主要定位于線粒體，與多種生物學功能密切相關，其中包括ATP生成，氧自由基清除及維持線粒體穩態等[3]。SOD-2及SIRT3都參與調節線粒體功能、抵抗氧化應激，在神經退行性疾病中起著關鍵作用。有研究表明，SIRT3能通過提高SOD-2活性，從而增強機體抗氧化的作用[4]。另外SIRT3協同SOD-2在衰老、致癌等方面也有著至關重要的作用[5-6]，但它們在AD發病機制中的作用報道甚少，本研究以人腦組織為標本，探討AD患者和對照組的不同腦區SOD-2和SIRT3的表達、分布及兩者的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1抗體試劑 兔多克隆抗SOD-2抗體(美國genetex公司)，小鼠多單隆抗SIRT3抗體(美國Santa Cruze公司)，山羊抗鼠IgG標記cy-3和山羊抗兔IgG標記488(美國Thermo Fisher Scientific公司)，免疫組織化學通用二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液、檸檬酸鹽、山羊血清(中杉金橋生物技術有限公司)

1.1.2人腦樣本 由荷蘭阿姆斯特丹人腦組織標本庫提供AD患者(AD組)及正常人(對照組)各10例尸體解剖后腦組織標本蠟塊，有大腦顳葉皮質、額葉皮質、海馬及小腦等不同腦區。AD患者死亡時平均年齡為(81.5±7.1)歲，正常對照組為(79.4±9.2)歲；AD患者和對照組的死后間隔時間(PMI，死亡和尸檢間隔)分別為(5.1±1.0)h和(8.0±3.4)h，研究對象的臨床和神經病理學特征見表1。AD診斷根據患者的病史、臨床表現和實驗室檢查，排除了其他可能的癡呆原因，同時根據美國國立神經病、語言交流障礙和卒中研究所標準對AD患者癡呆嚴重程度進行了臨床分級。患者與對照組腦組織標本在各種因素上均具有良好的匹配性，包括生前和死后相關因素。生前因素包括年齡、性別、疾病狀態和死亡時間，死后因素包括死后尸檢時間、固定方式、保存時間等[7-9]。所提供的AD樣本患者均未接受膽堿能抑制劑等特殊治療。本研究獲得貴州醫科大學倫理委員會批準(2018第67號)。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學染色 將不同腦區的石蠟包埋標本行腦組織切片，厚度6 μm，60～65 ℃烤片1 h，將切片置于二甲苯及不同濃度乙醇脫蠟水化，0.25% PBST緩沖液洗滌切片；隨后采用微波修復對切片進行組織抗原修復，待切片自然冷卻后于切片上滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；山羊血清工作液封閉1 h，滴加抗SOD-2(1∶200)、抗SIRT3(1∶200)抗體，4 ℃過夜，PBST緩沖液沖洗，滴加適量的反應增強液，室溫孵育20 min，PBST緩沖液再次沖洗，滴加增強酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育20 min；加入適量新鮮配置的DAB顯色液，室溫孵育5～8 min后，清水終止顯色；脫水、透明，中性樹膠封片，鏡檢。

表1 兩組研究對象的臨床和神經病理學特征Tab.1 Clinical and neuropathological characteristics of the patients with AD and control subjects

注：AD1～AD10為AD患者，NFT為根據神經纖維纏結的分布和數量對AD的分級，Aβ為根據老年斑對AD的分級

1.2.2結果判定 每張切片隨機選擇5個視野(原始放大倍數為200倍)，將5個視野的陽性蛋白表達平均灰度值作為每一張切片的陽性蛋白表達的灰度值。最后計算陽性細胞數以及SIRT3、SOD-2平均光密度(IOD)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 SOD-2表達

腦組織中SOD-2的表達定位于細胞質中(圖1A)。與對照組相比，AD組顳葉、額葉、海馬等腦區中SOD-2陽性細胞數(圖1B)及IOD值(圖1C) 均降低(P<0.05)；AD組和對照組小腦中SOD-2陽性細胞數及IOD值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

注：A放大200倍、白框中放大400倍，(1)與對照組比較，P<0.05圖1 SOD-2在AD組及對照組大腦顳葉、額葉、海馬和小腦的分布及表達(DAB染色)Fig.1 Immunohistochemical staining for SOD2 in cerebral temporal lobe, frontal lobe, hippocampus and cerebellum of patients with AD and control subjects

2.2 SIRT3表達

腦組織中SIRT3主要表達定位于細胞質中(圖2A)。半定量分析顯示，SIRT3陽性細胞數在AD患者顳葉、額葉、海馬中均少于對對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而在小腦中兩組SIRT3陽性細胞數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2B；同樣，IOD值在AD組顳葉、額葉、海馬中均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，在小腦中兩組IOD值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2C。

注：A放大200倍、白框中放大400倍,(1)與對照組比較，P<0.05圖2 SIRT3在AD患者及對照組大腦顳葉、額葉、海馬和小腦分布及表達(DAB染色)Fig.2 Immunohistochemical staining for SIRT3 in cerebral temporal lobe, frontal lobe, hippocampus and cerebellum of AD patients and control subjects

2.3 AD患者SOD-2與SIRT3表達的關系

AD患者腦組織中，SOD-2與SIRT3蛋白表達水平在大腦顳葉(r2=0.425，P=0.041)、額葉(r2=0.411，P=0.046)及海馬(r2=0.402，P=0.049)中呈正相關，說明隨著SOD-2蛋白水平降低，SIRT3蛋白水平也降低(圖3A、B、C)。在小腦中，這兩種蛋白之間則沒有相關性(r2=0.031，P=0.624)，見圖3D。

3 討論

AD病因十分復雜，涉及遺傳、環境等多種因素。大量研究表明，氧化應激損傷是AD發病機制中至關重要的影響因素[10]。Aβ的大量蓄積可直接破壞線粒體電子傳遞鏈，從而增加ROS的產生[11]，并且影響ATP的生成[12]。另一方面，作為氧化代謝的重要場所，同時也是ROS產生和消除的重要場所。線粒體內ROS水平升高，進一步可導致線粒體凋亡[13]。本研究以定位于線粒體的關鍵蛋白SOD-2及 SIRT3作為研究對象，探討兩者在AD患者中的表達及相關性。研究結果顯示，AD患者顳葉、額葉、海馬中，SOD-2及 SIRT3表達水平較對照組明顯降低，而在小腦未見明顯改變。

基于對抗氧化應激損傷的AD治療研究中發現，SOD-2基因多態性與AD的發生發展有關[14]，擬AD動物模型Tg2576小鼠中SOD-2的過表達可降低小鼠腦組織海馬過氧化物的含量，并可預防記憶缺陷[15]。進一步證實，SOD-2是線粒體內主要的氧自由基清除劑，在維持線粒體功能、體內外抗氧化損傷中發揮著主要作用。

圖3 AD患者大腦顳葉、額葉、海馬和小腦中SOD-2與SIRT3蛋白表達的相關性Fig.3 The correlation between SOD2 and SIRT3 in SOD-2 in cerebral temporal lobe, frontal lobe, hippocampus and cerebellum of AD patients

Sirtuins蛋白家族是一組依賴煙腺嘌呤二核苷酸(NAD)的去乙酰化蛋白，家族包括7個成員，其中SIRT3的活性形式存在于線粒體基質，通過去乙酰化作用調節線粒體代謝，包括ATP的產生，ROS的代謝和細胞凋亡。SIRT3基因與衰老密切相關[16]，且其升高能減輕Aβ的神經毒性，介導對神經退行性疾病的保護作用[17]。

SOD-2作為氧化應激反應中最重要最基礎的抗氧化酶，可能與共同表達在線粒體的SIRT3有著密切的聯系，或許介導其神經保護作用。研究表明，SOD-2與SIRT3聯系密切， SIRT3是通過SOD-2的增多來實現抗ROS的作用[18]。在成骨細胞分化過程中，SIRT3可通過改變SOD-2表達，清除線粒體內的ROS，促進成骨細胞分化，而敲除SOD-2和SIRT3基因后，可抑制成骨細胞分化[19]。另一方面，抑制SIRT3-SOD-2-線粒體信號通路，可誘導血管炎癥，促進動脈粥樣硬化[20]。而在神經退行性疾病中，模擬亨廷頓病和癲癇的SIRT3缺陷小鼠表現出更多的神經元損傷，這種損傷最主要原因也與SOD-2含量降低有關[21]。目前兩者在AD發病機制的研究較少，本研究結果顯示，SOD-2 及SIRT3在AD病變較重的腦區，如顳葉、額葉、海馬中表達減少，且在這3個腦區中，SOD-2表達與SIRT3表達存在正相關，說明SOD-2含量減少，SIRT3表達也減少，由此推測SOD-2與SIRT3共同參與了AD發病過程中線粒體能量代謝障礙的過程，從而導致抗氧化應激作用降低，可能是AD氧化應激假說的一個重要因素。

綜上所述，AD患者顳葉、額葉、海馬等腦區中SOD-2和SIRT3表達降低，SOD-2表達水平與SIRT3表達水平呈正相關，可能與該病的神經病理學改變有關。