亞硝態氮脅迫下菲律賓蛤仔實時定量PCR內參基因的篩選

王愛云，曹滕飛，呂家森, #，叢明

1. 魯東大學生命科學學院，煙臺 264025 2. 煙臺大學生命學院，煙臺 264003 3. 中國科學院煙臺海岸帶研究所，煙臺 264003

近岸海域是海水增養殖的重要區域，其水質狀況直接制約著該區域水產養殖業的健康發展?！吨袊逗Ｓ颦h境質量公報》顯示，我國近岸海域的局部海域水質污染程度較重，無機氮是主要的污染因子之一[1-3]，而氨氮和亞硝態氮是水環境中2種主要的有毒含氮化合物。環境中的氨氮在氨氧化細菌的作用下發生化學反應，轉化成亞硝態氮，后者在硝化細菌的作用下轉化成硝酸氮。由于近岸海洋環境中含氮有機污染物的濃度遠遠超過環境微生物的硝化能力，因此亞硝態氮成為近海海域一種常見的含氮污染物。我國淺海灘涂為貝類的黃金養殖地帶，近岸的亞硝態氮也就成為貝類養殖環境中不可忽視的污染物之一，嚴重威脅貝類養殖業的健康發展。國內外關于亞硝態氮對貝類的生態毒理研究，主要集中在致死效應和生理生化反應等方面[4-7]，毒性相關基因的研究比較少。

為了更好地研究亞硝態氮對貝類的毒性效應，尤其是從基因角度評價亞硝態氮毒性效應，需要一個合適的內參基因作為評價標準。據文獻報道，0.1～0.5 mg·L-1的亞硝酸鹽(以氮計)能對水生生物造成中毒癥狀，超過0.1 mg·L-1時會造成魚蝦等慢性中毒，而當亞硝酸氮濃度達到0.5 mg·L-1時，則會導致養殖生物大面積死亡[8-9]。為了研究低濃度亞硝態氮對貝類的毒性影響情況，本實驗采用0.2 mg·L-1亞硝酸氮作為脅迫濃度。貝類的鰓組織是重要的攝食、呼吸器官，也是與外界海水環境進行接觸的主要器官，因此被認為是最易受到外界環境脅迫的靶器官。本研究以菲律賓蛤仔的鰓組織為研究對象，采用0.2 mg·L-1亞硝酸氮作為脅迫濃度對菲律賓蛤仔進行不同時間(1 d、7 d)的脅迫實驗，利用內參基因分析軟件geNorm和NormFinder篩選穩定表達的內參基因。本研究的順利開展，將為研究菲律賓蛤仔鰓組織的毒理機制，篩選毒性關鍵基因提供基礎數據；為從基因的角度系統研究亞硝態氮對貝類的致毒機理，防治亞硝態氮引致的危害奠定基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

實驗用菲律賓蛤仔購于山東省煙臺市大潤發超市，選取足部伸縮有力、健康的菲律賓蛤仔(11±2.0) g作為實驗對象，暫養10 d。暫養和脅迫期間，全天連續充氣，水溫(20±2) ℃，鹽度30.0，pH值8±0.1，實驗用海水經過3級沙濾，每日喂食螺旋藻液1次(終濃度為5×103cells·mL-1左右)，在喂食前和喂食2 h后100%換水各1次。每天喂食換水后，在脅迫組水體中加入新鮮配制的亞硝酸鈉母液，使其氮濃度達到0.2 mg·L-1。亞硝酸氮濃度每天于喂食換水前和喂食2 h換水后各檢測1次(檢測方法參照GB/T 7493—1987)，亞硝酸氮濃度范圍為(0.24±0.04) mg·L-1。實驗設置脅迫時間為7 d，分別在實驗的第1和7天取樣，作為急性和亞急性脅迫樣品。

實驗用亞硝態氮源為亞硝酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司生產, 分析純)，烘干至恒重，用0.22 μm濾膜過濾除菌的海水配成1 mol·L-1的母液，避光冷藏保存，備用。本實驗設2組：對照組(0 mol·L-1)，脅迫組(0.2 mol·L-1)，每組設3個重復，每個重復用菲律賓蛤仔30只。每個重復隨機選取6只菲律賓蛤仔，取其鰓組織，將其完全浸入TRIzol液中，-20 ℃保存。

1.2 總RNA的提取及cDNA制備

用Trizol (TaKaRa)試劑盒提取菲律賓蛤仔鰓組織的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳(12.0 g·L-1)檢測其完整性和純度，用紫外分光光度計NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, America)確定RNA濃度，-80 ℃保存樣品總RNA。用試劑盒EraserPrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, 大連)去除基因組DNA (gDNA)后，再進行反轉錄實驗，獲得菲律賓蛤仔鰓組織的cDNA。采用SYBR Green qPCR (染料法)，使用20.0 μL的反轉錄體系，加入總RNA 1.0 μg、去除gDNA的反應液10 μL，其他成分和用量參照試劑盒說明；反轉錄程序：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃儲存，最后于-20 ℃保存反轉錄產物。

圖1 對照組和亞硝態氮脅迫組菲律賓蛤仔鰓組織總RNA凝膠電泳圖譜注：C1～12，Control組樣品1～12；N1～12，亞硝態氮脅迫組樣品1～12。Fig. 1 Gel electrophoresis of total RNA samples from the gill tissues of R. philippinarum in the control and nitrite-exposed groupsNote: C1-12 represented samples from the control groups; N1-12 represented samples from the nitrite-exposed groups.

1.3 引物特異性檢測

本研究選取微管蛋白基因(beta-tubulin,Tubu)、肌動蛋白基因(β-actin,Actin)、轉錄延伸因子基因(elongation factor 1-alpha,EF1α)、核糖體(18SrRNA, 18S)、泛素蛋白基因(Ubiquitin,Ubi)和親環素基因(cyclophilin A,CyPA)等6個基因作為候選內參基因。根據課題組前期實驗結果[10]，選用6對候選內參基因的引物并交由生工生物技術(上海)有限公司合成。利用普通PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳(12.0 g·L-1)驗證6對引物的可靠性。20.0 μL的PCR反應體系包括10 × PCR Buffer 2.0 μL，dNTP Mixture 1.5 μL，MgCl21.2 μL，Taq 0.2 μL，上、下游引物各1.0 μL，以等量混合的脅迫組和對照組鰓組織RNA反轉錄合成的cDNA做模板，用量1.0 μL，RNAase-Free Water 10.1 μL。反應程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環36次，最后，72 ℃保溫10 min，產物4 ℃儲存。

1.4 實時熒光定量PCR的擴增

將亞硝態氮脅迫的實驗組及對照組的cDNA各取2.0 μL混勻，將其濃度分別稀釋20、50、100、200、500倍作cDNA模板。按照SYBR Select Master qRT-PCR試劑盒 (MixApplied Biosystems, America)使用說明，在7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, America)上進行擴增反應。20.0 μL的反應體系包括SYBR Select Master Mix 10.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.6 μL，cDNA(50×)模板5 μL，ddH2O 3.8 μL。qRT-PCR反應程序為94 ℃預變性7 min；94 ℃變性10 s；60 ℃退火延伸30 s；循環40次。擴增實驗結束后，進行熔解曲線分析。

1.5 數據處理

根據7500 System Software獲取的qRT-PCR擴增曲線，用-2-ΔΔCt法[11]計算樣本的相對表達量；分別利用軟件geMorm和NormFinder對6個內參基因的表達穩定性值(expression stability value,M)進行評價，再采用加權賦值法[12]綜合比較基因的表達穩定性，從而確定最適合的內參基因。

2 結果(Results)

2.1 總RNA提取

隨機選取2個處理組的24個樣品進行瓊脂糖凝膠(1.2 g·L-1)電泳檢測，發現樣品總RNA 28S、18S、5S的條帶清晰(圖1)。NanoDrop 2000檢測其A260/A280在1.8～2.0范圍內，A260/A230均大于2.0，說明RNA的提取質量符合后續的qRT-PCR要求。

2.2 cDNA質量和引物特異性檢測

以鰓組織的混合cDNA為模板進行普通PCR擴增后，用12.0 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現擴增產物均為單一清晰條帶，且產物大小與目標產物大小匹配。熒光定量PCR熔解曲線分析顯示，6對引物的擴增產物均呈現單一峰且重復性好(圖2)。由此說明，所采用的6對引物不存在非特異性擴增，也沒有形成引物二聚體，均適用于qRT-PCR分析。將模板進行不同濃度梯度稀釋后用引物擴增，結果表明，cDNA模板稀釋50倍時，內參基因的Ct值均在12.0～25.0范圍內，適合作為檢測的模板濃度。

2.3 內參基因表達的穩定性評估

2.3.1 geNorm軟件評估

將對照組和亞硝態氮脅迫(1 d、7 d)的菲律賓蛤仔的鰓組織cDNA分別進行qRT-PCR擴增，用-2-ΔΔCt法計算出各候選基因的相對表達量，將其值輸入geNorm軟件進行分析。根據分析結果，獲得6個候選內參基因的平均表達穩定值M：18S(1.066)、Actin(0.829)、Tubu(1.195)、EF1α(0.938)、Ubi(0.948)和CyPA(0.882) (表1)。依據geNorm軟件的分析原則，M值越小，則說明該基因表達越穩定。因此，候選內參基因的表達穩定性由高到低依次排序為Actin>CyPA>EF1α>Ubi>18S>Tubu，即Actin和CyPA的表達相對穩定。

圖2 菲律賓蛤仔6個候選內參基因擴增產物的熔解曲線Fig. 2 Melting curves of 6 candidate reference genes from R. philippinarum

表1 geNorm評估6個候選內參基因的穩定性情況Table 1 Stability values of 6 candidate reference genes calculated by geNorm

注：C1、C2、C3表示對照組1、2、3號樣品；1day-1、1day-2、1day-3表示亞硝態氮脅迫1天的樣品1、2、3號；7day-1、7day-2、7day-3表示亞硝態氮脅迫7天的樣品1、2、3號。

Note: C1, C2, C3 stand for control 1, control 2, control 3; 1day-1, 1day-2, 1day-3 stand for sample 1, sample 2, sample 3 exposed to nitrite for 1 day; 7day-1, 7day-2, 7day-3 stand for sample1, sample 2, sample 3 exposed to nitrite for 7 days.

為了校正系統偏差，geNorm軟件一般選出2個以上的候選基因作為內參基因。內參基因數目的多少主要通過計算內參基因的配對差異值Vn/Vn+1來確定，其配對差異值以0.15為默認取舍值。當配對差異值小于0.15時，候選內參基因中適合作qRT-PCR內參基因的數目確定為n個[13]。本研究中配對差異值均大于0.15(圖3)。

2.3.2 NormFinder軟件評估

NormFinder軟件通過程序運行生成基因表達的穩定值，穩定值越低表明內參基因表達越穩定[14]。由軟件分析結果可知(表2)，基因的穩定性由高到低依次為Actin>Ubi>CyPA>EF1α>18S>Tubu，即Actin的表達穩定性最好。

2.3.3 內參基因表達穩定性綜合分析

根據軟件geNorm和NormFinder的分析結果，采用加權賦值法[12]，對每個基因的表達穩定性分別賦值后再求和，依據分數越小穩定性越好的原則，對結果重新排序，分數最小者排在第1位，其他依次排名為2、3、4、5、6位。統計結果顯示(表3)，得分最低的是Actin(2分)，排名第1，說明6個候選內參基因中Actin的表達穩定性最高，其他依次為CyPA、Ubi、EF1α、18S、Tubu。由此說明，菲律賓蛤仔受到亞硝態氮脅迫后，鰓組織中Actin基因的表達比較穩定，適合作為內參基因對其他基因的表達水平進行標準化分析。

3 討論(Discussion)

使用qRT-PCR技術分析目標基因的表達趨勢時，往往把內參基因作為數據標準化的對照進行校正[15]。在貝類生物中，開展了很多篩選相關內參基因的工作，為進一步研究貝類分子毒理學提供了參考依據。Bai等[16]篩選出了三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)在生物礦化過程中的內參基因Ubi、Rpl18和EF1α；不同組織和發育時期的合浦珠母貝(Pinctadafucata)[17]、不同發育階段和雌激素暴露后的櫛孔扇貝(Chlamysfarrer)[18]、以及多氯聯苯脅迫下紅樹蜆(Polymesodaerosa)[19]體內最穩定的內參基因均為Actin。鮑相渤等[20]分別探討了饑餓、致病菌感染和環境水溫脅迫條件下蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)成體的鰓、腎、閉殼肌組織、外套膜、血淋巴和肝胰腺等不同組織的適宜內參基因。本研究通過qRT-PCR比較了菲律賓蛤仔在亞硝態氮脅迫下鰓組織的6個候選內參基因的表達穩定性，確定了Actin為其最適內參基因。

圖3 geNorm評估6個內參基因的穩定性Fig. 3 Stability values of 6 reference genes calculated by geNorm

表2 NormFinder評估6個內參基因的穩定性Table 2 Stability values of 6 reference genes calculated by NormFinder

表3 內參基因穩定性的綜合分析Table 3 Comprehensive weighting comparison of reference genes’ stability

有大量研究認為，同一管家基因在不同細胞類型和不同生理狀態下的表達并不是恒定不變的[19,21-22]，但Actin基因的表達量在超過90%研究條件下都處于穩定狀態，適合單獨作為qRT-PCR的內參基因[23]。本研究所測試的6個表達量相對穩定的基因中，Actin基因同樣是表達水平最為穩定的一個。曹滕飛等[10]確定了氨氮脅迫后菲律賓蛤仔鰓組織中最適宜的內參基因為EF1α。由此可見，利用qRT-PCR研究基因表達的穩定性時，即便是同一物種的同一組織處于不同脅迫條件下，內參基因的選擇也會不同[19]，需要具體情況具體分析。

目前，用于評價內參基因表達穩定性的常用軟件有geNorm、NormFinder、BestKeeper等，但是采用不同軟件分別分析得到的排序結果之間往往存在差異，導致排序不一致，而綜合多個軟件的分析結果相互驗證則可提高研究的準確性[19,24-25]。geNorm是Vandesompele等[26]2002年開發的一款用于微軟Excell平臺的VBA宏程序，將計算平均表達穩定值M作為基因穩定性的評價指標，據M值分析得出配對差異值(Vn/Vn+1)，其配對差異值一般以0.15為默認取舍值，若Vn/Vn+1<0.15，則最適內參基因的數量為n個；若Vn/Vn+1>0.15，則最適內參基因的數量為(n+1)個。NormFinder是Andersen等[14]2004年研發的篩選穩定性內參基因的另一款程序，其程序計算原理和geNorm相似，也是先獲得內參基因的表達穩定值M，再根據M值的大小來篩選最適合的內參基因，M值越小越穩定。前者可用于篩選任何樣品的任何數量的內參基因，通過程序分析后確定適合的內參基因和最適宜的內參基因數目；后者則不僅能比較內參基因的表達差異，還可以計算樣品組間的差異，但只能篩選出一個最適合的內參基因[27]?？紤]到兩者程序計算原理的相似性，本實驗采用了geNorm和NormFinder兩個篩選軟件的評價結果相互驗證，但兩個軟件所獲得的基因表達穩定性順序出現了不一致，故利用Su等[12]的加權賦值法，綜合比較了geNorm和NormFinder的評價結果，從而獲得了這6個內參基因表達穩定性，表達較為穩定的基因為Actin和CyPA，Actin為最穩定的內參基因。

使用geNorm軟件分析內參基因穩定性時，可根據Vn/Vn+1(<0.15時)來確定內參基因的適宜數目，但geNorm使用指南中也明確地指出0.15并非嚴格標準值。多項實驗研究中也出現了差異分析值大于0.15的情況，鮑相渤等[20]認為不同組織間的Vn/Vn+1大于0.15，是不同組織的細胞類型和比例不同以及實驗中的候選基因有限所致。Li等[28]認為，在人類卵巢腫瘤的內參基因選擇中，Vn/Vn+1大于0.15是由內參基因的表達受組織類型及患者年齡、腫瘤的所處階段等生理因素和病理因素的影響不同而造成的。Penning等[29]比較貓不同組織中的10個候選內參基因的表達穩定性時發現，需同時選用6個內參基因才能保證對所有組織進行最佳標準化，而此時的Vn/Vn+1亦大于0.15。蔣婷婷等[30]對石蒜屬(Lycoris)植物內參基因的篩選、曹騰飛等[10]在篩選氨氮脅迫下菲律賓蛤仔的內參基因時均遇到了Vn/Vn+1大于0.15的情況，但結果并未拘泥于Vn/Vn+1≤0.15。本實驗中差異分析值Vn/Vn+1大于取舍值0.15，可能是在亞硝態氮脅迫后的不同時間段取材所導致的。