溢油污染物在櫛孔扇貝不同組織的富集特異性及生物放大效應的初步研究

景玉婷，李志林，張傳松,*，石曉勇，張海波

1. 中國海洋大學化學化工學院，青島 266100 2. 中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室，青島 266100 3. 國家海洋局海洋減災中心，北京 100194

石油是當今世界的主要能源之一，被稱為當今社會的“黑色黃金”、“經濟血液”。人類對于石油的需求不斷增長使得海洋石油勘探及運輸規模日益擴大，但隨之出現的是溢油事故頻發，對生態環境和海洋生物造成嚴重的破壞。溢油事故發生后，人們常使用消油劑(即溢油分散劑)來治理溢油污染。雖然大多數溢油消油劑本身的毒性比許多常用的化學制品小，但是仍然有一些消油劑本身比溢油對海洋生物的毒性更大[1-2]，因此須謹慎使用。

同時該類污染物會通過食物鏈的傳遞進入人體，進而危及人類健康與安全。由于貝類地理分布廣，生活方式固定，能夠累積其生活環境中的石油烴(TPH)，因此被許多國家和地區作為TPH污染監測的指示生物。目前海洋污染物在貝類體內的富集特征研究已有一些報道[3-5]，而關于TPH污染物在貝類不同組織內的富集特征的研究則鮮有報道[6]；此外，作為海洋生態系統中的初級生產力，海洋浮游植物處在食物鏈的最底層，相比其他海洋生物分布范圍更廣、數量更多，其受TPH等污染物的影響也最大，是TPH等污染物被海洋生物吸收和富集及在食物鏈傳遞過程中的第一層，因此在TPH污染物進入生物鏈的過程中起著關鍵作用。一旦浮游植物受到TPH的污染，TPH會通過食物鏈在海洋生物間進行傳遞并富集，也會對整個海洋生態系統的結構、穩定性和功能產生影響[7-9]，同時海洋污染物在海洋食物鏈中的傳遞研究主要集中在重金屬污染物[10-12]，而關于TPH污染物在食物鏈中的傳遞還相對較少。

三角褐指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)是海產養殖中的常用餌料，在甲殼類、雙殼貝類的苗種生產中起著重要作用[13]，并且對污染物有很高的累積能力，是海洋浮游生物毒性測試中常用的藻種；0#柴油是我國船舶應用最為廣泛的油品。因此，本研究選擇0#柴油為實驗油品，選用GM-2型消油劑，櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)作為受試生物，分別從溢油污染物在櫛孔扇貝體內不同軟體組織的富集特征、柴油組分從三角褐指藻到扇貝體內的傳遞2個方面，研究了TPH污染物對海洋生物的影響，該研究結果可以為溢油污染物對海洋生物的危害性評估提供數據支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

0#柴油(青島市某加油站)；溢油消油劑為GM-2型消油劑(青島市某環保公司)；實驗培養海水采自青島市沙子口附近海域，鹽度為27～30，pH為7.9～8.5，過濾后采用熒光法測定柴油的背景濃度；實驗所用容器為40 cm×40 cm×30 cm玻璃缸；日立熒光分光光度計F-4500(日本，島津)。

1.2 實驗生物

1)受試生物櫛孔扇貝采自沙子口海水養殖場，實驗前用干凈海水沖洗除去其表面附著物，在實驗條件下(溫度21 ℃±2 ℃、pH=8.0±0.3、鹽度29.0±1.0)馴養10 d，馴養期間連續通氣，每天換水一次，換水前2小時投喂定量綠藻粉，馴養結束后選擇健康且體長相近(6.0 cm±0.5 cm)的個體用于實驗。

2)三角褐指藻取自中國海洋大學海洋污染生態化學重點實驗室。藻種在室內光照培養箱內培養，培養條件為(22 ℃±2 ℃)，人工海水鹽度30.5，pH為8.1，光照強度3 500 Lux，光暗比為12 h:12 h。培養至指數期后重新接種到新的培養基中，依次循環培養3代，接種，備用。

1.3 0#柴油分散液和乳化液母液的制備與測定

柴油母液制備[14-15]：0#柴油與過濾后的海水以體積比為1:2的比例制備柴油分散液母液；按消油劑、柴油、海水以體積比為1:10:100的比例制備柴油乳化液母液。混合于三角瓶中，封口，置于磁力攪拌器上連續避光攪拌24 h。靜置8 h后虹吸下層液體即為母液，經0.45 μm的醋酸纖維膜過濾后轉移到棕色試劑瓶中，于4 ℃冷藏保存待用。

實驗液制備：0#柴油分散液和乳化液母液在使用前，依照《海洋監測規范》(GB 17378.4—2007[16]和GB 17378.6—2007[17])中的熒光分光光度法測定海水和生物體中石油烴的濃度，并按照實驗設計用海水稀釋至所需要的濃度。

1.4 實驗方法

1.4.1 柴油在扇貝體內不同組織的富集實驗

實驗設置4個實驗濃度組和一個對照組，各個實驗組濃度分別為0.05、0.1、0.3、1.0 mg·L-1，每個實驗濃度組設置3個平行組，每個平行組均放入45只經過馴養的櫛孔扇貝進行柴油富集實驗。每天定時充氧2 h，每12 h更換全量海水并加入相應體積的柴油母液，使實驗水體中TPH濃度保持相對穩定，每次換水前2小時喂養定量干凈的綠藻粉。富集實驗共進行8 d，分別在第0、1、2、3、5、8天的同一時間在實驗組和對照組的培養箱內同時隨機取出3只扇貝，其中1只扇貝解剖出整個軟體組織后用焙燒過的錫紙包好，裝于封口袋中，用于測定扇貝整體的TPH濃度，另外2只扇貝解剖出外鰓、內臟團、肌肉，用濾紙吸收其表面水分至不再自然流下，稱量濕重，用焙燒過的錫紙將軟體組織包好，裝于封口袋中，-20 ℃冷凍保存，用于測定不同軟組織中的TPH濃度。將樣品經冷凍干燥研磨后用超聲波提取-熒光分光光度法分析[18]。分別測定每個濃度組的3個平行組TPH濃度，并取平均值。

生物對污染物的蓄積能力通常用生物富集系數即BCF(Bioconcentration factors)表示，BCF值越大，生物對該污染物的蓄積能力越強，BCF按下式計算：

(1)

式中：Ca和Cw分別表示櫛孔扇貝體內和水體中TPH的含量(mg·kg-1)。

1.4.2 TPH在海水-三角褐指藻-櫛孔扇貝食物鏈中的傳遞實驗

1.4.2.1 三角褐指藻富集海水中的TPH

在2 L錐形瓶中加入相應體積的柴油母液和馴養的三角褐指藻，用人工海水稀釋到2 L，使水體中TPH濃度分別為0、1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1，藻密度約為1×104cell·mL-1。每組各設置一個空白對照，只加入柴油母液，不加藻。將錐形瓶置于光照培養箱中恒溫培養，條件為(22±2) ℃、3 500 Lux照度和12 h:12 h的明暗周期，連續培養7 d，每天取少量藻液計算藻密度，并取20 mL藻液過濾洗滌后測定其TPH濃度。7 d后將各瓶藻液分別離心，藻沉淀用少許上清液洗滌后再次離心，每次使用時取適量藻沉淀稀釋到100 mL后計數。

1.4.2.2 櫛孔扇貝富集三角褐指藻中的TPH

實驗在30 cm×25 cm×30 cm的玻璃魚缸中進行，設置2個實驗濃度組和1個對照組，每組各設3個平行，實驗水體為20 L，每個魚缸中放入15只馴養過的扇貝，分別取適量用1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1的柴油培養過的褐指藻沉淀稀釋到100 mL，計數后分別添加到2個實驗組，使各實驗組魚缸中藻密度均為4×104cell·mL-1左右。實驗進行8 d，每天更換全量海水并同一時間投喂等量的褐指藻。每天各魚缸分別取一只扇貝樣品，按1.3所述方法測定扇貝體內TPH濃度。

1.5 數據處理

在柴油由水體向三角褐指藻體內傳遞實驗中，采用“水相差法”[19-20]間接測定藻體內的污染物濃度。計算公式如下：

(2)

式中：Cw(c)為對照組水體中污染物的濃度(mg·L-1)，Cw(s)為實驗組水體中污染物濃度(mg·L-1)，Bt(cell·L-1)為t時刻水體中的生物量密度(以C計)，CA(mg·cell-1)為藻體內的TPH污染物濃度(生物量以C計)。

2 結果(Results)

2.1 柴油在櫛孔扇貝體內不同組織的富集

2.1.1 扇貝不同組織中TPH濃度隨時間的變化特征

各濃度序列實驗組中扇貝不同組織內TPH濃度隨時間變化的特征基本一致。下文以最大濃度組(1.0 mg·L-1)為例，討論在柴油分散液和柴油乳化液中扇貝不同組織內TPH濃度隨培養時間的蓄積變化情況(圖1)。在富集8 d條件下，隨著時間的推移，扇貝不同組織對柴油分散液和柴油乳化液中的TPH組分整體上均呈現持續富集的趨勢，且各時期富集量大小均表現為鰓>內臟團>肌肉。具體來說：在柴油分散液中，鰓內TPH濃度迅速上升而后趨勢逐漸減緩。鰓組織最先接觸散布在水體中的污染物，顆粒較大的分散油滴經過鰓時被濾掉，從而導致鰓富集柴油速度較快，且污染物濃度最大。內臟團中含有消化腺，其中含有重要的解毒器官肝臟，進入肝臟的少量柴油被消化腺分解后隨代謝排出，因此在實驗前期內臟的TPH濃度很低，而隨著暴露時間的增加，消化腺機能受到相應的影響，對柴油的代謝效率降低，肌肉和內臟團由此受到影響[21]，因此暴露實驗中后期內臟和肌肉內的TPH濃度增幅變大。類似鰓，整貝的TPH濃度也呈現前期平均富集速度高于后期的趨勢，但整貝的TPH濃度要遠遠小于鰓。到第8天富集實驗結束時，鰓內的TPH濃度遠大于內臟團、肌肉和整貝的TPH濃度。在柴油乳化液中，鰓和內臟團內的TPH濃度，同樣均出現前期平均富集速度高于后期的趨勢，在實驗的前5天，鰓內的TPH濃度大于內臟團，但相差不大。從第5天開始，鰓內TPH濃度略小于內臟團的TPH濃度，依然相差不大。同樣肌肉內TPH濃度上升幅度先增大后逐漸減小。類似內臟團，整貝的TPH濃度也呈現前期平均富集速度高于后期的趨勢。到第8天富集實驗結束時，鰓、內臟團和整貝的TPH濃度要遠大于肌肉內的濃度。

圖1 1.0 mg·L-1實驗組扇貝不同組織內總石油烴(TPH)濃度隨時間變化Fig. 1 Variations of total petroleum hydrocarbon (TPH) concentrations in different tissues of Chlamys farreri (1.0 mg·L-1 treatment) over time

添加消油劑后油滴顆粒變得更加細小均勻，更容易通過鰓的選擇后進入扇貝消化腺，這樣導致了平行組之間更加一致的吸收和釋放[21]。因此相同濃度條件下，添加消油劑的實驗組樣品濃度測定值與平行組測定值更加一致，同時過量的柴油無法被消化腺及時代謝，從而導致內臟團和肌肉內的TPH濃度增幅較大。因此在使用溢油消油劑時不應只考慮消油劑本身對海洋生態系統的影響，更應該考慮消油劑與溢油作用后的綜合影響，特別是對海洋生物的毒性，有必要在充分考慮溢油消油劑優點和毒性的基礎上建立溢油事故中消油劑的使用規范。

由《海水水質標準》可知，第一類海水水質要求TPH的濃度為0.05 mg·L-1以下，由《海洋生物質量》[22]標準可知，第一類海洋貝類體內TPH濃度要求小于等于15 mg·kg-1(濕重)。當扇貝處于TPH濃度大于0.05 mg·L-1的水體中超過3 d時，扇貝體內的TPH濃度便超過15 mg·kg-1，即超過第一類貝類質量標準，而當水體中TPH濃度小于0.05 mg·L-1時，扇貝體內的TPH濃度始終小于15 mg·kg-1。因此建議扇貝養殖者不要在超一類海水的區域進行水產品的養殖。同時隨著經濟的快速發展與人為活動的加劇，海洋石油泄漏問題更加需要引起有關職能部門的重視。

2.1.2 扇貝不同組織對柴油富集程度的比較

從圖1、圖2可以看出，扇貝不同組織內TPH含量與富集時間及水環境中的TPH濃度呈正相關，表明櫛孔扇貝對TPH具有較強的富集能力。櫛孔扇貝各軟組織在柴油分散液(a)和柴油乳化液(b)中富集階段結束(第8天)時的TPH濃度如圖2所示，在不同濃度的柴油溶液中，櫛孔扇貝的肌肉、鰓、內臟團對柴油均有一定的富集作用，各組織中的TPH濃度均隨環境中TPH濃度的增大而增大，且均為肌肉內濃度最低。在柴油分散液中，各個濃度條件下不同組織的富集量均為鰓(44.47～127.92 mg·kg-1)>內臟團(14.69～58.46 mg·kg-1)>肌肉(7.38～39.68 mg·kg-1)，鰓的TPH濃度遠大于內臟團和肌肉中的濃度，且整貝的濃度也隨著柴油暴露濃度的增大而增大。而在柴油乳化液中的扇貝表現出一定的差異，在較低濃度下(0.05～0.3 mg·L-1)，不同組織對柴油的富集量同樣有鰓>內臟團>肌肉，當水體中TPH濃度為0.05 mg·L-1時，內臟團和肌肉的TPH濃度相近且遠小于鰓的濃度，而隨著水體中TPH濃度的增大，肌肉的TPH濃度緩慢增加，內臟團中TPH濃度迅速增大，而當環境中TPH濃度達到1.0 mg·L-1時，內臟團的TPH濃度甚至超過了鰓的TPH濃度。說明在柴油添加消油劑后，TPH更容易經過鰓向內臟團傳遞，并且內臟團不能迅速地代謝所吸收的柴油，從而引起了肌肉組織內TPH濃度的增大。兩組實驗結果都顯示肌肉組織內TPH的富集量最小，且因此從飲食安全和產品開發角度上講，食用扇貝柱要比食用其他部位或整個扇貝肉安全得多。

扇貝不同組織在不同濃度的柴油分散液和柴油乳化液中對柴油組分的生物富集系數BCF(表1)大多表現為鰓(889.40～127.92 mL·g-1、830.80～123.43 mL·g-1)>內臟團(293.80～58.46 mL·g-1、184.00～130.53 mL·g-1)>肌肉(147.60～39.68 mL·g-1、149.80～62.40 mL·g-1)。就櫛孔扇貝整體對石油烴的富集而言，各實驗組扇貝在柴油乳化液中的BCF(404.6～91.75 mL·g-1)均大于同濃度的柴油分散液中的BCF(292.20～49.60 mL·g-1)。實驗結果表明：在柴油乳化液中，櫛孔扇貝對柴油有更高的富集能力，添加分散劑后增大了扇貝對柴油組分的吸收；扇貝在柴油分散液與柴油乳化液2種體系中的生物富集系數均隨著水體中TPH濃度的增大而減小，說明水體中TPH濃度越大，扇貝對其富集程度越小。而對于櫛孔扇貝不同組織的富集規律，將不同濃度組的櫛孔扇貝各組織BCF值進行方差分析發現：在95%的置信水平下外套膜、內臟團和閉殼肌BCF值之間存在顯著性差異(P<0.01)，表明各組織對TPH的富集能力不同。

圖2 扇貝在柴油分散液和柴油乳化液中暴露8 d后不同組織的TPH濃度Fig. 2 The concentrations of TPH in different tissues of Chlamys farreri after 8 d exposure

表1 扇貝在柴油分散液和柴油乳化液中的生物富集系數Table 1 The BCF values of Chlamys farreri in diesel dispersion and diesel emulsion

注：Cw表示水體中TPH的含量(mg·kg-1)，BCF表示生物富集系數(mL·g-1)。

Note:Cwstands for the concentration of TPH in different seawater (mg·L-1); BCF stands for the bioaccumulation factors (mL·g-1).

大量研究比較了扇貝不同組織對TPH的富集特征。本研究與一些抗菌藥物(如氨基脲和氟苯尼考等)在櫛孔扇貝中的富集規律一致[5,23]；趙美麗等[24]在扇貝不同組織對石油烴的富集實驗中，同樣發現：富集能力大小表現為鰓>消化腺>外套膜>肌肉；宮向紅等[6]研究了海灣扇貝對柴油的富集和消除規律，累積量表現為內臟>外套膜及鰓等其他組織>閉殼肌，與本文的研究結果略有差異，主要是因為宮向紅等沒有單獨檢測體液，而是與外套膜、鰓等組織混合檢測。出現這樣情況的原因可能是由于內臟團中消化腺的代謝過程而使其蓄積能力最強，而位于扇貝中心的肌肉組織內污染物濃度含量始終在3個組織中最小，因此食用肌肉比食用其他組織更安全。

2.2 TPH在海水-三角褐指藻-櫛孔扇貝食物鏈中的傳遞實驗

2.2.1 三角褐指藻富集海水中的TPH

圖3為各實驗組三角褐指藻的生長曲線，圖4分別為1.0 mg·L-1組(a)、2.0 mg·L-1組(b)水體中TPH濃度隨時間的變化曲線。從圖3可以看出藻密度在整體上隨培養實驗的進行而增加，具體表現為褐指藻在前2天處于適應期，藻密度基本不變，隨后褐指藻開始進入指數生長期，細胞密度迅速增加，經過3～4 d的指數生長，藻細胞到達相對穩定的平臺期。到第7天時，各實驗組藻密度分別達到1.80×106cell·mL-1、2.13×106cell·mL-1、1.42×106cell·mL-1。說明在營養鹽充足的環境中，高濃度的柴油會在一定程度上抑制三角褐指藻的生長，較低濃度的柴油在短期內反而會促進藻的生長。

水體中TPH濃度均隨培養實驗的進行而逐漸降低。具體特征表現為：1.0 mg·L-1實驗組和對照組在實驗的第1天TPH濃度均迅速降低，且降低幅度相近，由1.0 mg·L-1左右降低到約0.8 mg·L-1，從第2天開始對照組水體中TPH濃度只有微小的變化，而實驗組TPH濃度大幅度降低。到培養結束時，對照組水體中TPH濃度降低到0.76 mg·L-1，實驗組水體中TPH濃度降低到0.39 mg·L-1，根據“水相差法”的原理可認為由于藻的富集作用引起的水體中TPH濃度的變化為0.37 mg·L-1(扣除TPH揮發部分)。對比藻密度的變化曲線可知，三角褐指藻從第3天開始進入細胞指數生長期，因此三角褐指藻對柴油的吸收率急劇增加。同樣，2.0 mg·L-1的實驗組和對照組在培養的前2天TPH濃度也迅速下降，分別由最初的2.0 mg·L-1降低到約1.08 mg·L-1和1.73 mg·L-1。從第3天開始對照組水中的TPH濃度只有小幅度的變化，第4天時實驗組水體中TPH濃度大幅度降低，因為此時藻細胞進入指數生長期。到培養結束時，對照組水中TPH濃度降低到1.08 mg·L-1，而實驗組濃度降低到1.71 mg·L-1，由于藻的富集作用引起的水體中TPH濃度的變化約為0.63 mg·L-1。a、b實驗組由于藻的富集作用引起的水體中TPH濃度的變化和單個藻細胞內TPH濃度如表2所示。因此，海洋浮游植物作為食物鏈的最底層，其受TPH等污染物的影響最大，在TPH等污染物被海洋生物所吸收和富集以及進入生物鏈的過程中起著關鍵作用。

圖3 各實驗組三角褐指藻密度隨時間的變化Fig. 3 Variations of density of Phaeodactylum tricornutum Bohlin over the exposure time

圖4 水體中TPH濃度隨時間的變化曲線Fig. 4 Variations of TPH in water over the exposure time

圖5 投喂三角褐指藻后扇貝體內TPH濃度的變化Fig. 5 Variations of TPH in Chlamys farreri after fed with Phaeodactylum tricornutum

2.2.2 櫛孔扇貝富集三角褐指藻中的TPH

圖5為投喂柴油培養的三角褐指藻后的櫛孔扇貝體內TPH濃度隨時間的變化曲線，由圖可知：對照組扇貝體內的TPH濃度在整個實驗過程中變化不大，基本保持穩定，平均濃度為1.46 mg·kg-1。而投喂受柴油污染的三角褐指藻后扇貝體內的TPH濃度逐漸增大，到實驗結束時扇貝體內TPH濃度分別從1.51 mg·kg-1增加到7.79 mg·kg-1和9.61 mg·kg-1，說明攝食行為是環境中TPH污染物進入扇貝體內的一種方式。具體而言：1.0 mg·L-1實驗組扇貝體內TPH濃度在前2天增加緩慢，從第3天開始迅速增加隨后速度逐漸放緩，到第8天實驗結束時扇貝體內TPH濃度達到7.79 mg·kg-1左右。2.0 mg·L-1實驗組扇貝體內TPH濃度在實驗開始后便迅速增加，從第5天開始速度逐漸放緩，到第8天實驗結束時，扇貝體內TPH濃度達到9.61 mg·kg-1。在扇貝培養實驗過程中，2.0 mg·L-1實驗組扇貝體內TPH濃度始終大于1.0 mg·L-1實驗組，說明低營養級生物體內污染物濃度越大，則通過食物鏈向高營養級傳遞的量也越多。

本研究中2個實驗組扇貝所喂的褐指藻體內TPH濃度分別為1.74×10-10mg·cell-1和4.44×10-10mg·cell-1，后者濃度約為前者的2.59倍，而扇貝毒性實驗結束后2個實驗組扇貝體內TPH濃度分別達到為7.79 mg·kg-1和9.61 mg·kg-1，后者約為前者的1.23倍，表明在扇貝攝食褐指藻的過程中，并不能將藻體內的柴油完全吸收到自身體內，因為污染化合物在生物體內的富集還與攝食過程、生物的同化作用、排出過程以及其他理化因子有關[25]。當水體中TPH濃度增大時，褐指藻(低營養級)內TPH濃度增大，扇貝(高營養級)對柴油的富集也增大，表明柴油污染物可以沿著海水-三角褐指藻-櫛孔扇貝進行傳遞。

表2 三角褐指藻細胞內的TPH濃度Table 2 The concentration of TPH in Phaeodactylum tricornutum Bohlin

表3 藻體內和扇貝體內TPH濃度的關系Table 3 The relation of TPH concentration in Chlamys farreri and Phaeodactylum tricornutum

本實驗結果與韋麗麗等[10]對三峽庫區重金屬的生物放大研究的結果一致。雖然在本實驗條件下，扇貝通過三角褐指藻積累的柴油量始終未超過第一類生物質量標準值(15 mg·kg-1)，但實驗結果表明當低營養級即三角褐指藻內TPH濃度增大時，扇貝體內柴油的累積量也增大，因此對于扇貝養殖者來說，在育苗以及養殖過程中，要確保餌料中TPH濃度低于某些限定值，以免引起扇貝體內柴油富集量超過生物質量標準，該類濃度限定值有待進一步研究。

3 討論(Discussion)

(1)經過富集實驗，在不同濃度柴油分散液中，扇貝不同軟組織對柴油的富集量大小均表現為鰓(44.47～127.92 mg·kg-1)>內臟團(14.69～58.46 mg·kg-1)>肌肉(7.38～39.68 mg·kg-1)，在柴油乳化液較低濃度(0.05～0.3 mg·L-1)下也表現為此規律。結果表明，肌肉組織內TPH的富集量最小，因此從飲食安全和產品開發角度[53]上講，食用扇貝柱要比食用其他部位或整個扇貝肉安全得多。

(2) 當攝食受柴油污染的三角褐指藻后扇貝體內對柴油產生了一定的累積，在實驗結束時，扇貝體內柴油的累積量隨藻體內TPH濃度的增大而增大，表明柴油污染物可以沿著海水-三角褐指藻-櫛孔扇貝進行傳遞。同時，正是由于TPH污染物能夠沿著食物鏈在營養級間進行傳遞，因此當溢油事故發生后需要及時消除溢油，防止石油污染物沿著食物鏈進行傳遞，并且由于溢油分散劑能夠顯著增加芳香烴等有生物毒性的物質的溶解度，因此在消除溢油時要規范合理使用分散劑，以減少TPH中有毒成分沿食物鏈到達人體的可能性。