IGF-2在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

金銀 姜亦珍 桂琦

結直腸癌是癌癥相關死亡的第三大原因[1]。而胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）與腫瘤發生、發展及轉移的關系密切，近年來引起國內外廣泛關注。目前有研究提到IGF-2可作為多種腫瘤的預后分子標志物[2]。本文對IGF-2在結直腸癌組織中的表達及臨床意義進行分析，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取本院2017年1月至2018年5月確診為結直腸癌的79例患者，其中男50例，女29例；年齡33～81（64.36±8.95）歲；直腸癌 58 例，結腸癌 21 例；伴有淋巴結轉移30例，伴有遠處轉移13例，無淋巴結及遠處轉移36例；TNM分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期20例，Ⅲ期17例，Ⅳ期19例。入選標準：（1）經病理學檢查確診為結直腸癌；（2）未行手術、放化療；（3）病理類型為腺癌。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）合并嚴重心肺疾病；（3）合并克羅恩病、潰瘍性結腸炎等其他腸道疾病。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過，所有患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織標本獲取 將術中獲取的結直腸癌組織切成0.5cm左右的小塊，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 結直腸癌組織中IGF-2 mRNA表達的檢測 采用qRT-PCR法。將結直腸癌組織標本56℃液化1h，提取總RNA；取5μl總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測其完整性。逆轉錄按照BIOMIGA公司逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，-80℃保存備用。按照美國BIOMIGA公司的SYBR GreenⅠ說明書配制qRT-PCR反應體系，取cDNA進行qRT-PCR。反應條件：95℃預變性10min；95℃ 15s，60℃ 1min，共40個循環。每個樣品設置3個復孔。以GAPDH作為內參基因，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。GAPDH引物：正向5′-GAAAAGAAGGACCCCAGAA-3′，反向 5′-TGCTGTGTGTTGTGTGTGTC-3′。IGF-2 引物：正向 5′-CTTGGACTTTGAGTCAAATTGG-3′，反向 5′-GGTCGTGCCAA TTACATTTCA-3′。2-ΔΔCt表示樣品中目的基因相對表達量，其中ΔCt=樣本Ct均值-內參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機陰性對照樣品Ct均值-該樣品內參Ct均值）。

1.2.3 結直腸癌組織中IGF-2蛋白表達的檢測 采用免疫組化染色法。對結直腸癌組織標本進行固定、浸泡、浸蠟、包埋、切片、脫蠟處理，并將其浸泡于3%雙氧水中20min。PBS沖洗組織切片3次以上（＞15min），再將700ml檸檬酸緩沖液（pH6.0）放入燒杯加熱；當檸檬酸緩沖液沸騰后，將組織切片置入燒杯內；15min后將組織切片取出，在常溫下冷卻5min，PBS（pH 7.4）沖洗3次以上（＞15 min）。對組織切片進行一抗處理，并置于4℃冰箱孵育；第2天取出組織切片，PBS（pH 7.4）再次沖洗。對組織切片進行二抗處理，然后常溫孵育10min，使用PBS（pH 7.4）進行沖洗。使用二氨基聯苯胺顯色溶液對組織切片進行顯色處理，再用清水進行沖洗；用蘇木精對組織切片進行襯染，透明脫水樹膠進行封固；染色完成后，在光學顯微鏡下觀察組織切片。IGF-2蛋白表達結果的判定[3]：染色強度無色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞所占比例≤1%為0分，＞1%～10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度分值與陽性細胞所占比例分值的乘積＜3分為陰性，3～4分為弱陽性，5分為中等陽性，≥6分為強陽性。

1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或單因素方差分析；等級資料的比較采用Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織中IGF-2 mRNA表達與患者臨床特征的關系 結直腸癌中IGF-2 mRNA表達與TMN分期有關，即分期越高，mRNA相對表達量越高，差異有統計學意義（P＜0.05）；結直腸癌中IGF-2 mRNA表達與患者年齡、性別、BMI、腫瘤部位均無關，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 結直腸癌組織中IGF-2 mRNA表達與患者臨床特征的關系

2.2 結直腸癌組織中IGF-2蛋白表達與臨床特征的關系 結直腸癌組織中IGF-2蛋白表達與TMN分期有關，即分期越高，蛋白表達越強，差異有統計學意義（P＜0.05）；結直腸癌組織中IGF-2蛋白表達與患者年齡、性別、BMI、腫瘤部位均無關，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 2。

表2 結直腸癌組織中IGF-2蛋白表達與患者臨床特征的關系（例）

3 討論

目前關于結直腸癌的病因不明，其相關危險因素有吸煙、飲酒、高脂肪低纖維飲食、加工紅肉或酒精的微生物代謝物介導的腸道菌群改變等[3-5]。結直腸癌是一種可能涉及到多個步驟、多個階段及多個基因共同參與的細胞遺傳學疾病；在細胞發生癌變過程中，逐漸發生基因突變和癌變[6-7]。近年來研究發現，胰島素、IGF參與腫瘤的發生、發展和轉移[8-11]。IGF是一類多肽激素，具有與胰島素類似的功能和結構[12]。IGF-2是IGF家族中調節生長發育的多肽生長因子之一，在發育過程中通過表觀遺傳、轉錄和翻譯機制微妙地控制其表達[13]。它是一種7.5KDa的有絲分裂肽激素，主要由肝臟產生，也可自分泌或由旁分泌的組織分泌[14]；它也是胎兒發育的主要生長因子，其mRNA表達在腎、肝組織中均有下調，而通常在癌組織中過表達[14]。

體外實驗表明，IGF-2 mRNA一般由乳腺癌成纖維細胞表達，外源性IGF-2可支持人乳腺癌細胞在無血清、無雌激素培養基中旺盛生長[12]。原位雜交研究表明，在乳腺癌中IGF-2 mRNA完全由惡性腫瘤間質表達，與IGF-2蛋白染色密切相關[12]；該研究還表明，IGF-2蛋白在大多數腫瘤的上皮和間質中表達，IGF-2在乳腺癌中的表達與乳腺癌生長與分化的2個重要調控因子有關[12]。IGF-2過表達發生在多數肉瘤中，常伴IGF-2位點印跡丟失；約50%的子宮平滑肌肉瘤IGF-2高表達，對于腫瘤上皮間室IGF-2表達水平高于本研究隊列中值的患者，其疾病進展或死亡風險約增加1倍[15]。在上皮性卵巢癌和其他癌癥中，胎兒IGF-2啟動子的重新激活和IGF-2過表達與預后惡化有關[15]。

本研究結果顯示，不同年齡、性別、BMI、腫瘤部位的結直腸癌患者腫瘤組織中IGF-2 mRNA及蛋白表達比較，差異均無統計學意義；但是TMN分期越高，結直腸癌患者腫瘤組織中IGF-2 mRNA及蛋白表達越強。實驗表明，IGF-1、IGF-1R、IGF-2R、IGF-2 的表達涉及某些腫瘤的分化和轉移，提示分期越高，相對表達量越高。Liu等[16]研究表明，miRNA-30a通過下調IGF-1R抑制結直腸癌轉移。IGF-2具有促進細胞有絲分裂、刺激細胞增殖及DNA復制和轉錄、刺激組織器官生長和分化等作用，IGF-2的促細胞增殖作用不僅體現在正常細胞，也可以通過旁分泌或自分泌方式促進腫瘤細胞的增殖[17]。張德芳[18]研究表明，IGF-2及IGF結合蛋白的表達可能與結腸癌患者的腫瘤分期、臨床上常規腫瘤標志物存在一定的聯系。高表達的miR-483-5p能通過上調IGF-2基因p3 mRNA轉錄，以促進肝癌細胞的發生、發展。

綜上所述，本研究認為IGF-2可能參與結直腸癌的發生、發展，可為作為預測結直腸癌的一項參考指標。