消石通顆粒質量標準研究*

崔恩忠，唐安福，貢 磊，湯

（中國人民解放軍東部戰區總醫院制劑科，江蘇 南京 210002）

消石通顆粒為我院院內制劑，由金錢草、冬瓜皮、徐長卿、海金沙、車前子、雞內金、石韋、白茅根、瞿麥蓄和甘草共11味中藥組方，具有清熱解毒、利尿通淋的功效，主治石淋，用于尿路結石、尿路感染等，處方復雜，所含藥味種類繁多，成分復雜。因此本試驗中采用薄層色譜（TLC）法對方中金錢草、雞內金和甘草3味藥進行鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對制劑中所含綠原酸總量進行測定，進一步完善其質量標準[1-3]，從而更好地控制其質量[4-5]。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters1525型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；FA1104型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ-500DE型超聲機（昆山市超聲儀器有限公司）；調溫電熱器（南通通州申通電熱器廠）；HH-6型數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

試藥：對照藥材金錢草（批號為120923-201113），雞內金（批號為121072-201109），甘草（批號為110756-200110），對照品綠原酸（批號為110753-200413），均購自中國食品藥品檢定研究院；消石通顆粒（醫 院 自 制，批 號 分 別 為150316，150504，151213，160627，161115）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 薄層色譜鑒別

金錢草：取樣品，研細，稱取40 g，加100 mL乙醇回流2h，過濾，取濾液，蒸干，加30mL水溶解，分別用10 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸干后加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取金錢草對照藥材1 g，粉碎，加50 mL水煎煮3次，每次1 h，合并煎液并濃縮至30 mL，過濾，取濾液，蒸干，殘渣加30 mL水溶解，用乙酸乙酯萃取，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。再按處方比例稱取缺金錢草的處方藥材，制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照TLC法試驗[1]，分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液與陰性對照品溶液10，20，20μL進樣，展開劑為甲苯-二氯甲烷-丙酮-甲醇（35∶25∶30∶10，V∶V∶V∶V），展開，取出，晾干，并噴5%磷鉬酸乙醇溶液。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾（圖1 A）。

圖1 薄層色譜圖

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖

雞內金：取本品，研細，稱取40 g，加100 mL乙醇回流1 h，過濾，取濾液，蒸干，加30 mL水溶解，醇沉后靜置2 h，過濾，取濾液，將乙醇蒸干，加30 mL水與1 mL鹽酸，加熱回流1 h，放冷，用15 mL正丁醇萃取3次，合并萃取液，蒸干，加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取雞內金對照藥材1 g，粉碎，加50 mL水與1 mL鹽酸，煎煮3次，每次1 h，合并煎液并濃縮至30 mL，醇沉，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。再按處方比例稱取缺雞內金的處方藥材，制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照TLC法試驗[1]，吸取上述3種溶液各20μL進樣，展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5，V∶V∶V）的上層溶液，展開，取出，晾干，并噴0．2%茚三酮乙醇溶液，105℃烘約5 min至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾（圖1 B）。

甘草：取本品，研細，稱取30 g，加50 mL甲醇超聲30 min，過濾，取濾渣，揮干，加適量水溶解，用20 mL乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材0．25 g，粉碎，加20 mL乙醚超聲30 min，棄去乙醚液，濾渣揮干，加20 mL甲醇超聲30 min，過濾，殘渣蒸干后加甲醇1 mL溶解，作為對照藥材溶液。再按處方比例稱取缺甘草的處方藥材，制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照TLC法試驗[1]，吸取上述3種溶液各4μL進樣，展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5，V∶V∶V）的上層溶液，展開，取出，晾干，并噴0．2%茚三酮乙醇溶液，105℃烘約5 min至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，而陰性對照無干擾（圖1 C）。

2．2 綠原酸含量測定

2．2．1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0．4%冰醋酸溶液（20∶80，V∶V）；檢測波長：327 nm；柱溫：35℃；流速：1．0 mL／min；進樣量：10μL。

2．2．2 溶液制備

取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇適量，制成每1 mL含35．6μg的溶液，即得對照品溶液。取樣品10 g，精密稱定，置100 mL燒杯中，加約90 mL沸水，攪拌溶解，放冷后離心5 min（5 000 r／min），取上清液，加水定容至100 mL，攪勻，即得供試品溶液。按比例稱取處方藥材飲片（除金錢草、石韋、蓄、白茅根、車前子外），根據制劑工藝制備消石通顆粒陰性樣品，依法制備陰性對照品溶液。

2．2．3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2．2．2項下3種溶液各10μL，按擬訂色譜條件進樣測定，結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應保留時間處有同一色譜峰，而陰性對照無干擾。詳見圖2。

線性關系考察：分別精密量取對照品溶液8，6，5，4，2 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成 質 量 濃 度 為35．6，28．48，21．36，17．14，14．24，7．12μg／mL的系列對照品溶液，各吸取10μL，按擬訂色譜條件測定，以進樣質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=29 121X＋25 142，r=0．999 2（n=6）。結果表明，綠原酸質量濃度在7．12～35．60μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液，精密吸取10μL，按擬訂色譜條件連續進樣5次，記錄綠原酸峰面積。結果的RSD為0．69%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為150316）適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，在常溫下分別于0，2，4，6，8，12 h時進樣，記錄峰面積。結果的RSD為0．80%（n=6），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為150316）6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定峰面積，計算含量。結果的RSD為2．13%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取綠原酸對照品17．80 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得178μg／mL的對照品貯備液。取已知含量的樣品（批號為150316，綠原酸含量為0．145 mg／g），研細，取粉末9份各5．00 g，平均分成3組，分別精密加入對照品貯備液3．30，4．00，5．00 mL，依法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 綠原酸加樣回收試驗結果（n=9）

2．2．4 樣品含量測定取3批樣品（批號分別為151213，160627，161115），依法制備供試品溶液，進樣測定峰面積。結果含量分別為0．081，0．129，0．169 mg／g。

3 討論

薄層鑒別項選擇：經查閱文獻并經試驗考察發現，2015年版《中國藥典（一部）》暫未收載處方中冬瓜皮、石韋的薄層鑒別標準[6]，海金沙、瞿麥、蓄、白茅根均有陰性干擾，故最終篩選金錢草、雞內金及甘草作為薄層鑒別項。

含量測定指標選擇：2015年版《中國藥典（一部）》暫未收載處方中海金沙、雞內金、瞿麥、白茅根、冬瓜皮5味藥材含量測定項；而車前子、徐長卿和甘草中所含京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、丹皮酚、甘草酸和甘草苷等化學成分[7-9]的含量太低；此外，金錢草、石韋和蓄等藥中均含有槲皮素、山柰酚和綠原酸等成分，但因該制劑制備工藝中所有藥材均為水提取，導致成品中這3種成分含量并不高。現代藥理學研究表明，綠原酸為眾多藥材和中成藥抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分，同時也是質量控制的重要指標[10-12]。鑒于綠原酸在制劑臨床療效中發揮重要作用，且根據課題審評會專家意見，最終選擇綠原酸總量作為制劑質量控制指標。

色譜條件選擇：參考2015年版《中國藥典（一部）》金銀花藥材中綠原酸的含量測定方法，選擇最大吸收波長為327 nm。根據文獻研究和試驗考察，流動相選擇甲醇-0．4%冰醋酸溶液（20∶80，V∶V）時，色譜峰有較好的分離度，且峰形良好，故確定文中流動相。

提取溶劑用量選擇：考察了5倍、10倍、15倍水提取條件下綠原酸的提取率，結果10倍水提取時，樣品中總綠原酸已基本提取完全，故最終選擇10倍水提取。

綜上所述，本研究中建立的金錢草、雞內金和甘草的TLC鑒別方法及總綠原酸的HPLC含量測定方法，穩定、可靠，可用于消石通顆粒的質量控制。