動(dòng)物藥羊膽水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉春花，熊丹丹，潘 潔，劉紹歡，李勇軍，王愛民，王永林，4△

（1．貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心·省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550004； 2．貴州醫(yī)科大學(xué)·貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004； 3．貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004； 4．貴州醫(yī)科大學(xué)·貴州省民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽550004）

膽汁作為一類重要?jiǎng)游锼嶽1]，除了熟知的熊膽、牛膽、蛇膽外，羊膽也是常用中藥。羊膽首載于陶弘景《本草經(jīng)集注》，《中藥大辭典》記載羊膽來源于牛科山羊?qū)賱?dòng)物山羊Capra hircus Linnaeus、綿羊?qū)賱?dòng)物綿羊Ovis aries Linnaeus或山羚屬動(dòng)物青羊Naemorhedus goralHardwicke的膽汁[2]。《遼寧中藥志（動(dòng)物、礦物、海洋類）》[3]《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）[4]中記載羊膽的來源是牛科動(dòng)物山羊Capra hircusLinnaeus或綿羊OvisariesLinnaeus的膽汁。宰羊時(shí)，剖腹，割取膽囊，將膽管扎緊，懸通風(fēng)處晾干，或取新鮮膽汁入藥[2]。羊膽藥性苦寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清熱解毒、明目退翳、止咳等功效[2，5]，主治目赤腫痛、青盲夜盲、翳障、肺癆咳嗽、小兒熱驚、咽喉腫痛、黃疸、痢疾、便秘、熱毒瘡瘍等[2，4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，羊膽有明顯的抗炎活性[5-7]，治療肺結(jié)核的療效確切[8]，具有良好的藥用價(jià)值。山羊或綿羊的膽汁主要含膽汁酸鹽、膽色素、黏蛋白、膽甾醇、卵磷脂、脂肪酸及碳酸氫鈉等[2，9]，動(dòng)物膽汁中含量最高的物質(zhì)主要為膽酸和脫氧膽酸[10]。

目前，關(guān)于羊膽的質(zhì)量控制研究報(bào)道較少，《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）[4]收錄了羊膽水，《福建省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2006年版）[11]收錄了羊膽膏，《寧夏中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1993年版）[12]收錄了牛、羊膽汁，對羊膽的質(zhì)量控制項(xiàng)目較單一，均無含量測定項(xiàng)目，不能較好地控制羊膽的質(zhì)量。本研究中采用薄層色譜（TLC）法、總固體含量測定和高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行研究，同時(shí)分析多批羊膽水樣品，為羊膽水的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

REPROSTAR3型薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士Camag公司）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；Prominence型高效液相色譜儀（日本島津企業(yè)管理＜中國＞有限公司）；EL204型電子天平（Mettler公司）；EL-204型電子天平（萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；KQ-300DE型超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1．2 試藥

羊膽粉對照藥材（批號為121524-201202），膽酸對照品（批號為100078-201415），均購于中國食品藥品檢定研究院；冰醋酸、三氯甲烷、異丙醇、甲醇、硫酸、磷鉬酸均為分析純，乙腈為色譜純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠，煙臺黃海江友硅膠開發(fā)有限公司，青島鼎康硅膠有限公司）；羊膽水10批，分別編號為S1（貴陽花溪）、S2（貴州習(xí)水）、S3（貴州鳳崗）、S4（貴州丹霞）、S5（貴州金沙）、S6（貴州習(xí)水）、S7（盤州板橋）、S8（貴州興義）、S9（貴州龍里）、S10（貴州貴陽），均在采收地宰殺現(xiàn)場收集，均來源于山羊，宰殺前均由貴州醫(yī)科大學(xué)中藥標(biāo)本館龍慶德副教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2．1 羊膽水TLC鑒別

分別量取10批羊膽水樣品各0．5 mL，置70℃水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL，超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取羊膽粉對照藥材10 mg，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材溶液。照TLC法（2015年版《中國藥典（四部）》通則0502）試驗(yàn)，分別吸取不同批次供試品溶液與對照品溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板，以異丙醇-三氯甲烷-冰醋酸-甲醇（30∶20∶4∶4，V∶V∶V∶V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴含3．5%磷鉬酸的20%硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見圖1。不同批次間可能各成分含量不同，因此對應(yīng)斑點(diǎn)顏色深淺存在差異。

2．2 總固體含量測定

取新鮮羊膽水，搖勻，精密量取10 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，置105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算供試品中新鮮膽汁干燥后所得質(zhì)量，結(jié)果見表1。10批羊膽水總固體含量范圍為0．046 1～0．076 0 g／mL，相差1．6倍。

2．3 羊膽水中膽酸含量測定

2．3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

圖1 羊膽水薄層色譜圖

表1 各批羊膽水總固體含量（g／mL）

色譜柱：Phenomenex Luna-C18柱（250mm×4．6mm，5μm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：乙腈-0．1%磷酸溶液（45∶55）；流速：1 mL／min；檢測波長：192 nm；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：35℃。按擬訂色譜條件吸取對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各5μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在此條件下，膽酸與其他組分峰的分離度大于1．5，且空白無干擾，詳見圖2。

2．3．2 溶液制備

取膽酸對照品0．013 52 g，精密稱定，置2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為6．760 g／L的對照品溶液。再精密吸取上述溶液1 mL置5 mL容量瓶中，加10%甲醇定容，稀釋成質(zhì)量濃度為1．352 g／L的膽酸對照品溶液。

精密量取羊膽水5mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理15 min，放冷，用甲醇定容，過濾，精密吸取續(xù)濾液5mL，蒸干，加20%氫氧化鈉10 mL，回流2h，放冷，加稀鹽酸調(diào)pH至2～3，用乙酸乙酯萃取4次，每次15 mL，合并乙酸乙酯層溶液，蒸干，加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2．3．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2．3．2項(xiàng)下對照品溶液（質(zhì)量濃度為6．760 g／L），用甲醇逐級稀釋至質(zhì)量濃度為3．3800，1．690 0，0．845 0，0．422 5 g／L。按擬訂色譜條件測定，以待測物的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得膽酸的回歸方程Y=10．448X＋1．011（r=0．9995）。結(jié)果表明，膽酸質(zhì)量濃度在0．4225～6．760 0 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為S5）樣品，分別精密吸取羊膽水樣品處理項(xiàng)下量（5 mL）的3個(gè)水平（50%，100%，150%）2．5，5．0，7．5 mL，各3份，共9份，依法制備供試品溶液，照擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算膽酸含量。結(jié)果膽酸平均含量為16．65 g／L，RSD為1．49%（n=9），表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗(yàn)：在與重復(fù)性不同的試驗(yàn)時(shí)間（不同天），分別吸取羊膽水5 mL共3份，依法制備供試品溶液，照擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算膽酸含量。結(jié)果膽酸平均含量為16．67 g／L，RSD為0．34%（n=3），表明方法中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12 h時(shí)進(jìn)樣分析。結(jié)果不同時(shí)間峰面積的RSD為1．97%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取與重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下同批樣品2．5 mL，共9份，以重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（膽酸含量為16．65 g／L）計(jì)算羊膽水中膽酸的本底，分別按50%，100%，150%3個(gè)水平加入膽酸對照品，各3份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2．4 樣品含量測定

精密量取不同批次羊膽水5 mL，各2份，依法制備對照品溶液與供試品溶液，按擬訂色譜條件各進(jìn)樣5μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見表3。可見，5批羊膽水藥材中膽酸含量在7．537～19．660 g／L。不同來源的羊膽水中膽酸含量差異較大，相差2．6倍，這可能與動(dòng)物生長的環(huán)境存在一定關(guān)系。

圖2 高效液相色譜圖

表2 膽酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表3 各批樣品中羊膽水含量測定結(jié)果（g／L）

3 討論

3．1 TLC條件選擇

曾對羊膽水的TLC鑒別方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，包括不同的供試品制備方法的考察，直接利用不同試劑對羊膽水進(jìn)行萃取和羊膽水揮干后用不同溶劑提取，最后發(fā)現(xiàn)直接揮干羊膽水后，加甲醇提取效果較好，同時(shí)還考察了甲醇的提取時(shí)間和溶劑體積等，得到最佳提取方法。通過對羊膽水TLC條件的優(yōu)化，包括不同展開系統(tǒng)和比例、不同視檢方法等，最終明確最佳色譜條件。最后考察了所建立TLC法的耐用性試驗(yàn)，包括樣品溶液的穩(wěn)定性、不同廠家薄層板、不同展開環(huán)境溫度和相對濕度，最終發(fā)現(xiàn)耐用性良好，不同批次樣品與對照藥材分離結(jié)果良好。

3．2 HPLC法條件與方法選擇

羊膽水中含有多種化學(xué)成分，其中膽酸是其主要化學(xué)成分，占比最大[13-14]，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗菌、鎮(zhèn)靜等作用[15]，其可能是羊膽水中的主要活性成分，因此選擇膽酸作為指標(biāo)成分，建立HPLC含量測定方法。首先，考察了不同的樣品處理方法，包括不同超聲處理時(shí)間、氫氧化鈉用量和濃度、回流時(shí)間、萃取次數(shù)等，最終得到最佳提取條件。同時(shí)優(yōu)化了色譜條件參數(shù)，分別考察了最佳吸收波長、色譜柱、流動(dòng)相比例和pH、流速、柱溫，得到最佳色譜條件。然后進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明方法專屬性強(qiáng)，分離度良好，均符合要求，最終對10批樣品進(jìn)行含量測定，發(fā)現(xiàn)來源不同使羊膽水樣品中膽酸含量存在較大差異，也可能與動(dòng)物的生長年限、生長環(huán)境有關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。羊膽水屬液體藥物，因此測定了其總固體的含量，結(jié)果最大值與最小值相差1．6倍，這也可能是由動(dòng)物的個(gè)體差異導(dǎo)致。

綜上所述，不同來源的羊膽水的總固體含量、膽酸含量均存在差異，造成差異的原因可能與羊的生活環(huán)境、食物、性別和羊自身的健康狀態(tài)及羊膽水收集的季節(jié)等因素有關(guān)。所用羊膽水均為山羊的膽汁，并未收集綿羊的膽汁，2種來源不同的羊膽水中膽酸含量是否存在差異，具體影響膽酸含量差異的因素需作進(jìn)一步研究。