應用GeneXpert法檢測沈陽地區某醫院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌耐藥基因的研究

侯博研 張智潔 周秀珍 王虹 陳愉中國醫科大學附屬盛京醫院呼吸與危重癥醫學科，沈陽 0004；中國醫科大學附屬盛京醫院檢驗科，沈陽 0004；中國醫科大學第七臨床學院 遼寧省健康產業集團撫礦總醫院呼吸科，撫順 000

肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae，KP)屬革蘭陰性桿菌，是一種條件致病菌，常存在于人體上呼吸道和腸道。肺炎克雷伯菌引起的醫院感染率近期逐年增高，已成為醫院及社區獲得性感染的重要病原菌之一[1-2]。碳青霉烯類抗菌藥物是針對革蘭陰性菌的廣譜β-內酰胺類抗菌藥物，曾被認為是自20世紀80年代來對抗多藥耐藥革蘭陰性菌的最后一道防線。隨著臨床廣譜抗菌藥物的過度應用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯桿菌(Carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP)的出現，導致臨床幾近無藥可用，患者治療費用增加，病死率增加，給臨床抗感染治療提出了巨大困難和挑戰[3-5]。腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的機制中關注度最高的因素為攜帶產碳青霉烯酶耐藥基因。本研究對北方地區CRKP對常見抗菌藥物的耐藥性及5種耐藥基因進行了檢測分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2013年1月至2017年6月盛京醫院微生物室從不同病區各種臨床標本培養出的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌60株，標本類型包括：血液痰、尿液、導管末端、穿刺液、胸水等。剔除同一患者重復菌株。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 試劑和儀器 腸桿菌科藥敏板卡；美羅培南、亞胺培南、厄他培南藥敏紙片(溫州市康泰生物科技有限公司)；哥倫比亞血瓊脂培養基(梅里埃生物制品有限公司)；MH平板(梅里埃生物制品有限公司)；Xpert Carba-R試劑盒(GXCARBARCE-10美國賽佩公司)；Vitek 2細菌全自動鑒定儀(法國生物梅里埃公司)；Gene-Xpert XVI-4-2檢測儀(808400美國賽佩公司)；生物安全柜(海爾公司)；細菌培養箱(Thermo公司)；比濁儀(法國生物梅里埃公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 VITEK 2 Compact法細菌鑒定和藥敏分析

(1)菌株復蘇：三區劃線法將保存菌株在血平板上，細菌培養箱35℃孵育16～24 h；(2)在載卡架上放試管，每管中加入3 ml NaCl溶液；(3)配制比濁濃度0.5麥氏單位的菌懸液； (4)取145μl上述菌懸液與3 ml 0.45%NaCl混合，震蕩混勻；(5)將藥敏板卡放在卡架上，卡片輸樣管插入到菌懸液中，啟動檢測；(6)讀取結果。

1.3.2 擴散法(Kirby-Bauer紙片擴散法)藥敏實驗 (1)菌株復蘇(同上)；(2)配制比濁濃度0.5麥氏單位的菌懸液；(3)用無菌棉簽蘸取菌液，擠壓去除多余菌液后均勻涂抹于MH培養基上，切換角度分別涂抹3次，最后沿培養基內緣均勻涂抹一周并蓋上蓋子；(4)置室溫干燥3～5 min后用鑷子將藥敏拭子貼于培養基面上；(5)培養箱孵育18～24 h；(6)量取抑菌環直徑，判讀結果。

1.3.3 GeneXpert法檢測耐藥基因 (1)菌株復蘇(同上)；(2)在載卡架上放一次性塑料試管，每管中加入3 ml生理鹽水；(3)配制比濁濃度0.5麥氏單位的菌懸液；(4)吸取10μl至樣本處理液，漩渦震蕩10 s；(5)吸取約1.7 ml混合液加入試劑盒內，蓋上試劑盒蓋子啟動檢測；(6)判讀結果。

1.4 判定及排除標準 (1)耐碳青酶烯類肺炎克雷伯菌判定標準[6]：根據美國臨床實驗室標準委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2016年版標準(CLSIMl00-S26)，抑菌圈直徑：厄他培南≤18 mm、亞胺培南和美羅培南≤19 mm判斷為耐藥或VITEK-2藥敏顯示這三種抗生素中介、耐藥，需進行手工法確認。對亞胺培南、美羅培南或厄他培南中至少一種耐藥的菌株為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌；(2)排除標準：剔除重復標本。

1.5 統計學分析 應用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，各組間率的比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌對常見抗菌藥物的藥敏結果 我院分離的60株CRKP對常用的16種抗生素藥敏結果顯示(表1)：阿米卡星敏感度最高達78.95%；左氧氟沙星及環丙沙星敏感率分別為48.28%和43.10%；氨基糖苷類中的慶大霉素和妥布霉素、磺胺類中的復方新諾明敏感率分別37.93%、35.71%及29.31%；呋喃妥因敏感率為5.26%，中介率為28.95%；青霉素類、β-內酰胺酶抑制劑、頭孢類以及其他β-內酰胺類中的氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢替坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑林、氨芐西林/舒巴坦敏感率0%～15.52%。

表1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌對常見抗菌藥物的藥敏結果

2.2 CRKP耐藥基因檢測結果 收集我院60株CRKP應用GeneXpert方法檢測5種耐藥基因結果顯示(表2、3)：攜帶碳青霉烯酶49株，占81.67%；其中，攜帶KPC酶30株，占50%；攜帶NDM酶28株，占46.67%；攜帶IMP-1酶3株，占5%；未攜帶碳青霉烯酶11株，占18.33%。攜帶單一KPC酶19株，占31.7%；攜帶單一NDM酶18株，占30%；攜帶單一IMP-1酶1株，占1.7%；同時攜帶KPC和NDM酶9株，占15%；同時攜帶KPC和IMP-1酶1株，占1.7%；同時攜帶IMP-1、KPC和NDM酶1株，占1.7%；其余型耐藥基因未檢出。

2.3 是否檢出耐藥基因與亞胺培南藥物最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)分析結果 亞胺培南藥物敏感性MIC值與是否檢出耐藥基因差異存在統計學意義(表4)，檢出耐藥基因菌株對亞胺培南耐藥更嚴重。

2.4 檢出耐藥基因數與患者預后分析結果 檢出耐藥基因數量與患者預后差異無統計學意義(表5)，未檢出耐藥基因臨床菌株、檢出1種耐藥基因臨床菌株及檢出2種及以上耐藥基因臨床菌株對患者病情好轉及痊愈或死亡及病情加重退院差異無統計學意義。

表2 60株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌菌株各耐藥基因檢出數量

表3 60株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌菌株耐藥基因檢出情況

表4 是否檢出耐藥基因與亞胺培南藥物敏感性MIC值分析

表5 檢出耐藥基因情況與患者預后分析(株)

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物在國內外均有廣泛應用，常用的碳青霉烯類包括有：亞胺培南(泰能)、厄他培南(怡萬之)、美羅培南(美平)、比阿培南等。CRKP由Mack-enzie等于1997年在美國北卡羅萊納州首次發現，此菌能夠水解并產生碳青霉烯酶[7]。之后陸續在國內外出現報道，并且大多數表現快速增長的趨勢。近年耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)的檢出率呈逐年升高趨勢，Marsik和Nambiar[8]報道，CRE分離率2008年為0.6%，2016年上升至6.4%。

本研究中，該菌對抗感染治療常用的16種抗生素中氨基糖苷類中的阿米卡星敏感性最高達78.95%，臨床可選擇作為治療藥物，但單藥治療常難以控制感染。喹諾酮類中左氧氟沙星及環丙沙星敏感率分別為48.28%和43.10%，也可作為僅次于阿米卡星用于控制該菌感染的第二選擇。氨基糖苷類中的慶大霉素和妥布霉素、磺胺類中的復方新諾明敏感率分別37.93%、35.71%及29.31%，不適合用于控制沈陽地區CRKP的感染。呋喃妥因敏感率為5.26%，中介率為28.95%，亦不適合用于控制該菌的感染。青霉素類、β-內酰胺酶抑制劑、頭孢類以及其他β-內酰胺類中的氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢替坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑林、氨芐西林/舒巴坦敏感率在0%～15.52%。在臨床治療中，應根據抗菌譜、抗生素的效能及藥敏結果，遵循耐藥率由低到高的原則選擇耐藥率小于30%的抗菌藥物以降低耐藥現象的出現。可以看出，我院分離出CRKP菌株對常見抗菌藥物的耐藥情況不容樂觀，β-內酰胺類抗生素是治療腸桿菌科細菌感染的有效抗菌藥物，但隨著產β-內酰胺酶的腸桿菌科細菌廣泛出現，此類抗菌藥物的抗感染治療作用明顯下降。并且，研究發現某些種類的β-內酰胺類抗生素對腸桿菌科細菌存在接種效應。接種效應是指在細菌的接種濃度增高100倍時，抗菌藥物的最低MIC值至少升高8倍的現象，這種程度不同的接種效應導致很多β-內酰胺類藥物即使體外藥敏試驗結果敏感也不推薦于臨床應用。據文獻報道，部分感染致病菌不僅對β-內酰胺類耐藥率高，而且呈現出多重耐藥現象，有少部分CRKP菌株對阿米卡星、喹諾酮類敏感，這些藥物可以聯合應用治療CRKP[9]。研究顯示，多黏菌素對耐碳青霉烯類腸桿菌CRE有相對較好的體外抗菌活性，可選擇作為治療藥物[9-10]。早期文獻報道多黏菌素可產生腎毒性及神經毒性，曾因此在國內臨床應用逐漸減少。近年來國內外研究人員對多黏菌素進行了更深入的研究，之前的報道中由于研究對象差異大、缺少對照研究、給藥量不同等而對多黏菌素不良反應的估計存在一定程度的夸大，并且多藥耐藥的革蘭陰性桿菌的迅速增多并且常導致嚴重感染，使黏菌素再次受到關注。替加環素對多重耐藥的革蘭陰性桿菌抗菌效果好，是目前為數不多對CRE有抗菌作用的高效的廣譜抗菌藥物之一[11]。聯合用藥能提高治療效果并有利于預防細菌耐藥性的產生。

雖然腸桿菌科細菌耐藥機制多為攜帶產酶耐藥基因，但耐藥基因的流行和分布情況在不同種屬細菌中存在差異。Ambler分類法根據氨基酸序列的相似性把β-內酰胺酶分為4類(A、B、C、D)，其中A類、B類、D類中存在能水解碳青霉烯類的酶，因此被稱為碳青霉烯酶[12-13]。A類中最具有代表意義的酶型是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemases，KPC)，也是最具有臨床意義的酶型，屬于典型的非金屬碳青霉烯酶。早年攜帶KPC酶耐藥基因是肺炎克雷伯桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥最常見的機制。KPC耐藥基因可經整合子、質粒與插入序列基因原件進行傳播，存在局部爆發的潛在威脅[14]。澳大利亞2012年報道了第1例臨床分離產KPC酶KP，該患者感染前曾去過希臘[15]。法國Meaux醫療中心曾報道過產KPC酶在KP中出現小范圍的流行，經MLST分型實驗結果均為ST512型，之后證實與一例意大利感染患者有關[16]。之后診斷這類細菌感染的患者中也多有在其他國家旅行的經歷[17]。攜帶KPC耐藥基因的KP與感染患者在不同國家之間的旅行傳播有密切關系。我國于2007年初次發現產KPC酶的KP[18]。B類碳青霉烯酶比較常見的酶型有IPM型及VIM型。近年報道新發現的新德里金屬β-內酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)也屬于B類酶。2007年末印度籍瑞典男性在新德里地區某醫院手術后并發感染，于2008年初回到瑞典。該患者在住院期間，分別注射了加替沙星、阿莫西林克拉維酸、阿米卡星、甲硝唑等藥物。2008年1月，在該患者尿液中分離到的KP進行研究發現一種新型金屬β-內酰胺酶，此株細菌對絕大多數抗生素耐藥。經英國Cardiff大學的Timothy R Walsh教授團隊分析，是一種金屬β-內酰胺酶，被命名為NDM-1型[19]。NDM-1酶對碳青霉烯類、β-內酰胺類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等抗生素有耐藥性。目前，攜帶NDM耐藥基因菌的感染已經從印度、巴基斯坦等國家傳播到英國、美國、德國、法國、澳大利亞、加拿大、西班牙、比利時、日本、荷蘭國家[20-23]。D類碳青霉烯酶一般在腸桿菌科細菌中較少見。KPC型碳青霉烯酶是導致腸桿菌出現耐藥性的關鍵，其原因可能是頭孢菌素酶的表達強度過大，造成其與外膜孔蛋白的合并發生丟失，因此大大降低了碳青霉烯類抗生素與青霉素結合蛋白結合能力，使得碳青霉烯類抗菌素水解而產生β-內酰胺酶，最終導致耐藥菌的產生[24]。產NDM菌一半以上分離自印度，可通過質粒在細菌間自由移動、復制和傳播，可在細菌之間傳遞，近幾年在我國呈逐年增多趨勢，散發分布且波及菌種較多，主要在華東地區報道較多，已報道的有大腸埃希菌、克雷伯菌屬、不動桿菌屬等[25]。上海一項研究報道，2010～2013年從上海新華醫院臨床樣本中分離到CRKP77株，其中69株攜帶KPC基因，占90%。經測序為KPC-2基因，這些菌株可能通過患者院內轉科形成播散[26]。廣州市一項研究報道，南方醫科大學附屬廣州軍區廣州總醫院分離2015年26株CRKP，經PCR檢測結果25株攜帶KPC酶，1株攜帶IMP酶，未檢測出OXA-48、VIM、NDM酶[27]。

本研究中顯示，沈陽地區60株CRKP攜帶碳青霉烯酶49株；以攜帶KPC及NDM酶型為主，偶見攜帶IMP-1酶型，其余耐藥基因型未檢出。本次實驗檢出耐藥基因型與我國南方地區報道存在差異，可能存在地域差異導致耐藥基因檢出不同以及隨時間推移耐藥基因型別分布發生變化等。關于兩種或兩種以上碳青霉烯酶在同一菌株中分離的報道也越來越多。2012年印度首次分離到一株同時攜帶KPC和NDM基因的KP[28]。KP中發現的耐藥基因類型也逐年增多，這些耐藥基因主要存在細菌的質粒中，通過細菌與細菌之間的傳播進而導致醫院感染及流行。此次實驗中檢測常見五種基因型(KPC、NDM、IMP-1、OXA-48、VIM)，這樣無法排除是否存在其他類型耐藥基因，并且未檢出耐藥基因的CRKP菌株可能存在例如外排泵等其他的耐藥機制。Tzouvelekis等[29]研究報道在15項研究中50例碳青霉烯類單藥治療的CRE感染，碳青霉烯類藥物MIC＞8 mg/L時碳青霉烯類治療失敗率高達75%。本實驗發現檢出耐藥基因臨床菌株對亞胺培南藥物敏感性MIC≥16 mg/L與未檢出耐藥基因臨床菌株差異有統計學意義。懷疑細菌感染的患者，應盡早留取標本行藥物敏感性及耐藥基因檢測。

本實驗中應用的GeneXpert儀器是全自動一體化的半巢式熒光PCR檢測系統，該系統將PCR樣品制備和檢測程序設定于一體，對樣品完全自動化地進行核酸提取、純化、擴增與檢測，應用即時的光學檢測軟件，一旦發現目標基因便可以得出結果，極大地減少了檢測所需時間。GeneXpert系統全程檢測均在封閉試劑盒中全自動進行，確保結果準確可靠。從患者標本采集至送檢及結果回報可在2 h內完成，可以及時指導臨床醫生調整治療方案降低治療失敗率。本研究通過收集臨床資料分析，檢出耐藥基因數量與患者預后差異無統計學意義，此結果可能與患者存在其他基礎疾病等影響因素、藥物敏感性結果回報時間、臨床抗菌藥物應用及機體的差異性有關。據報道，感染CRE的患者或CRE無癥狀攜帶者有有可能成為感染源[30]。產NDM酶細菌可能主要會從危重患者、插管和機械通氣患者和老年人等易感人群身上分離出來，甚至引起院內傳播[31]。加強醫護人員手衛生、遵守操作規范、加強消毒隔離措施，減少院內感染的發生，爭取做到早發現、早隔離、早診斷、早治療。同時開展相關調查研究，及時了解這類菌株耐藥現狀、流行趨勢及特點。CRKP已經引起世界范圍關注，所以實驗室及臨床上應給予此類細菌監測足夠的重視，以防CRKP耐藥菌株暴發流行。