玉米芯木聚糖的提取及其相對分子質(zhì)量分布研究

樊洪玉， 衛(wèi) 趙 劍， 蔣劍春

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室;國家林業(yè)和草原局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點實驗室;江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點實驗室, 江蘇 南京 210042;2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所, 北京 100091)

隨著石油、煤炭等不可再生化石資源總量日趨減少，由可再生植物纖維生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化獲得新材料、高熱值能源、化工原料及藥物正成為一種重要的發(fā)展趨勢[1]。其中，農(nóng)林廢棄物是可再生的、價廉易得且具有發(fā)展前景的生物質(zhì)資源。在植物原料中，半纖維素是除纖維素以外的第二大組分[2]，主要存在于植物的細(xì)胞壁中。在細(xì)胞壁中半纖維素與纖維素和木質(zhì)素相互連接，與纖維素主要是通過物理作用(即氫鍵)緊密結(jié)合，并通過共價鍵(主要是R-芐基醚鍵)與木質(zhì)素相連接[3]。由于植物纖維中的各組分相互交聯(lián)且緊密結(jié)合，所以很難將與纖維素和木質(zhì)素相連的半纖維素分離出來[4]。因此尋找一種既能最大限度地將半纖維素分離出來，又能盡量減少或避免其在提取過程中發(fā)生變化的方法，是實現(xiàn)半纖維素綜合利用的關(guān)鍵。我國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，每年產(chǎn)生幾億噸的農(nóng)業(yè)廢棄物。若就地燃燒或掩埋不僅會污染環(huán)境，而且還會造成大量的資源浪費。玉米芯中半纖維素高達41%左右，且為聚木糖類半纖維素，已廣泛用于制備糠醛、低聚木糖(XOS)等多種工業(yè)產(chǎn)品[5]。近年來，研究者開始利用玉米芯半纖維素來開發(fā)高附加值的化學(xué)品和醫(yī)藥產(chǎn)品，并期望其能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[6]。由于半纖維素屬于天然產(chǎn)品，分離過程中結(jié)構(gòu)多變，致使制備的半纖維素產(chǎn)品分散度高，為相對分子質(zhì)量大小不一的混合體。若不加以純化，易造成后續(xù)產(chǎn)品性能不穩(wěn)定，關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)難以確定，進而難于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此，制備分散度低、性能穩(wěn)定的半纖維素是其高附加值工業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前，提取半纖維素(木聚糖)的方法主要有溶劑法、堿法、酸法、酶法以及附加物理、化學(xué)的輔助方法等。由于酸法制備木聚糖易降解、對設(shè)備腐蝕性大，溶劑法和酶法處理量小、效率低。因此，本研究選擇堿性過氧化氫溶液對玉米芯木聚糖進行提取分離，采用單因素試驗考察了不同工藝參數(shù)對提取得率的影響，從而確定了最佳工藝；再采用乙醇分級沉淀法制備低分散度的木聚糖，并采用多種方法對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行了分析與表征，以期為玉米芯半纖維素的高值化利用提供參考。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

玉米芯取自山東省聊城市，經(jīng)自然風(fēng)干后，選擇無霉變、無蟲蛀的玉米芯，破碎，過250 μm篩。將得到的玉米芯粉末用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液在索氏提取器中抽提12 h，脫除蠟質(zhì)[7]，用去離子水洗滌，真空干燥，置于干燥器中備用。原料的主要化學(xué)組成可參照美國國家可再生能源實驗室標(biāo)準(zhǔn)NREL/TP-510- 42618測定，測得玉米芯原料含纖維素39.03%、半纖維素33.18%和木質(zhì)素14.23%。

無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、過氧化氫等，均為市售分析純；D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等標(biāo)準(zhǔn)品，均為色譜純，西格瑪-奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

Dionex ICS-3000戴安多功能離子色譜儀，ED電化學(xué)檢測器，色譜柱為CarbopacTM PA-20柱(4 mm×250 mm)；Thermo Fisher Nicolet iS 10傅里葉紅外光譜(FT-IR)儀；Bruker WNMR-I-500MHz型核磁共振(NMR)波譜儀；美國TA公司Q50型熱重(TG)分析儀。

1.2 玉米芯木聚糖的制備

將脫蠟后的玉米芯粉末50 g加入1 000 mL去離子水，75 ℃抽提3 h以獲得水溶性多糖(WSP)。固液分離，向濾渣中加入堿性過氧化氫溶液(1% H2O2和5% NaOH)，在不同的反應(yīng)條件下進行加熱反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓過濾，用鹽酸中和至pH值為中性，減壓濃縮，向濃縮液中加入定量的無水乙醇，靜置過夜，離心分離，使用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液洗滌固體沉淀，以除去表面附著的無機鹽和反應(yīng)過程中生成的小分子物質(zhì)，最后冷凍干燥即得到木聚糖產(chǎn)品，放入干燥器中保存?zhèn)溆谩Ｄ揪厶堑寐拾聪率接嬎悖?/p>

y=m/m0×100%

式中：y―木聚糖得率，%;m—乙醇沉淀的木聚糖的質(zhì)量,g;m0—玉米芯中半纖維素的總質(zhì)量,g。

1.3 梯度乙醇分級沉淀法分離玉米芯木聚糖組分

在最佳條件下提取的半纖維素提取液中加入乙醇，使濾液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、45%、60%和75%，離心分離，固體沉淀經(jīng)洗滌后得到木聚糖產(chǎn)品，采用冷凍干燥和真空干燥2種方式進行干燥，干燥后的木聚糖樣品分別標(biāo)記為D10～D75和H10～H75。

1.4 分析與表征

1.4.1糖組分分析 使用高效陰離子交換色譜測定所制備木聚糖的糖類組分和含量。準(zhǔn)確稱取150 mg(精確到0.1 mg)的樣品放入三角瓶中，然后加入1.50 mL的72%的硫酸，攪勻，放在(30±3) ℃恒溫?fù)u床中60 min。隨后使用42.00 mL去離子水將其沖洗到壓力瓶中，使硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，搖勻，放入高壓釜，在121 ℃下對樣品及標(biāo)樣水解1 h，冷卻到室溫。酸解液稀釋一定倍數(shù)后，過0.22 μm微孔水相濾膜后進行糖組分分析。每個實驗做3～6個平行，取平均值。

1.4.2FT-IR分析 對制得的低分散度木聚糖樣品進行紅外光譜分析，儀器的分辨率優(yōu)于4 cm-1，樣品的掃描次數(shù)為16次/s，掃描波數(shù)范圍為525～4000 cm-1。

1.4.3NMR分析 將木聚糖樣品(1H NMR 20 mg，13C NMR 80 mg)溶于1 mL含有少量NaOD的D2O中。其中1H NMR譜的掃描數(shù)為2 000，13C NMR譜的掃描數(shù)為10 000，脈沖寬度均為11.5 μs，延遲時間均為2 s。

1.4.4TG分析 對木聚糖產(chǎn)品進行熱穩(wěn)定性分析，在N2氣氛中，將樣品以10 ℃/min的升溫速率由50 ℃升至600 ℃，分析低分散度木聚糖產(chǎn)品的熱失重行為。

1.4.5相對分子質(zhì)量測定 通過凝膠滲透色譜(GPC)來測定木聚糖的相對分子質(zhì)量，木聚糖的多分散性系數(shù)(D)可以使用重均相對分子質(zhì)量(Mw)與數(shù)均相對分子質(zhì)量(Mn)的比值來表示。檢測所用色譜柱型號為Waters styrage HT6，柱溫箱溫度為25 ℃，檢測器為SFD RI-2000示差折光檢測器，流動相為0.001 mol/L NaOH溶液，流速為1 mL/min，進樣質(zhì)量濃度0.2 g/L。

2 結(jié)果和討論

2.1 不同條件對木聚糖提取得率的影響

2.1.1堿質(zhì)量分?jǐn)?shù) NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響玉米芯木聚糖得率的關(guān)鍵因素，在反應(yīng)時間為16 h，液固比為20∶1(mL∶g,堿性過氧化氫溶液體積與玉米芯質(zhì)量比，下同)，反應(yīng)溫度為50 ℃，過氧化氫質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的條件下，考察了NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2.5%、5%、7.5%和10%)對玉米芯木聚糖得率的影響，結(jié)果見圖1(a)。由圖可知，當(dāng)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)由2.5%增加到5%時，玉米芯木聚糖得率從75.82%增加到最大值83.15%。當(dāng)堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過5%時，隨著堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，玉米芯木聚糖的得率急劇下降。當(dāng)堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至10%時，大部分木聚糖發(fā)生了水解，得率僅為32%。因此，選擇NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。

2.1.2液固比 液固比在堿性過氧化氫溶液提取玉米芯木聚糖的過程中具有重要的作用，在反應(yīng)溫度為50 ℃，反應(yīng)時間為16 h，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的條件下，考察了液固比(10∶1、 15∶1、 20∶1、 25∶1)對玉米芯木聚糖得率的影響，結(jié)果見圖1(b)。由圖可知，隨著堿性過氧化氫溶液(1%H2O2，5%NaOH)體積的增加，玉米芯木聚糖的得率也逐漸增加。當(dāng)液固比由10∶1增加到20∶1時，玉米芯木聚糖的得率由56.45%迅速增加到80.44%。但是繼續(xù)增加堿性過氧化氫溶液的體積，玉米芯木聚糖的得率基本不變。因此選擇最佳液固比為20∶1。

2.1.3反應(yīng)溫度 反應(yīng)溫度過低木聚糖很難充分提取，反應(yīng)溫度過高會使木聚糖糖鏈發(fā)生降解，從而導(dǎo)致木聚糖的得率降低。在堿性過氧化氫溶液(1% H2O2，5% NaOH)中，反應(yīng)時間為16 h，液固比為20∶1的條件下，考察了反應(yīng)溫度(40、45、50、55和60 ℃)對玉米芯木聚糖得率的影響，結(jié)果見圖1(c)。由圖可知，當(dāng)反應(yīng)溫度從40 ℃升到50 ℃時，玉米芯木聚糖的得率迅速增加。在50 ℃玉米芯木聚糖得率達到最大值83.15%。繼續(xù)增加反應(yīng)溫度，玉米芯木聚糖的得率反而有所下降。這可能是因為反應(yīng)溫度過高，導(dǎo)致玉米芯木聚糖發(fā)生了降解。因此，選擇反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.1.4反應(yīng)時間 反應(yīng)時間是影響玉米芯木聚糖得率的另一重要參數(shù)，在堿性過氧化氫溶液(1% H2O2，5% NaOH)中，當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃，液固比為20∶1時，考察了反應(yīng)時間(10、12、14、16、18和20 h)對玉米芯木聚糖得率的影響，結(jié)果見圖1(d)。由圖可知，當(dāng)反應(yīng)時間為10～14 h時，隨著反應(yīng)時間的增加，玉米芯木聚糖的得率由30.81%迅速增加至80.44%；14～16 h時，玉米芯木聚糖得率的增長速度變慢，16 h的木聚糖得率達到最大值83.15%；繼續(xù)延長反應(yīng)時間至20 h時，玉米芯木聚糖的得率幾乎不變。因此，選擇最佳反應(yīng)時間為16 h。

a. NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaOH mass fraction; b. 液固比值liquid to solid ratio; c. 反應(yīng)溫度temperature; d. 反應(yīng)時間time

綜上，提取玉米芯木聚糖的最佳工藝為堿性過氧化氫溶液(1% H2O2，5% NaOH)中、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間16 h、液固比為20∶1，在此條件下所得玉米芯木聚糖的得率為83.15%。

2.2 梯度乙醇分級沉淀法分離玉米芯木聚糖組分

2.2.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對各級分得率的影響 在熱水抽提之后，得到0.49%的水溶性多糖(WSP)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、45%、60%和75%時，可以分別沉淀出10.3%、3.6%、4.2%、1.6%、1.3%和1.7%的木聚糖各級分。與較高體積分?jǐn)?shù)的乙醇相比，較低體積分?jǐn)?shù)的乙醇可以使較多的木聚糖級分沉淀出來。通過梯度乙醇分級沉淀法從玉米芯中提取的木聚糖占干燥脫蠟玉米芯總量的22.7%，得率為68.41%。

2.2.2單糖組分分析 WSP和梯度乙醇沉淀法制備玉米芯木聚糖的單糖組分含量分析如表1所示。從表1可以看出，WSP中含葡萄糖最高，為48.93%，其次是木糖為32.24%，并且還含有少量的阿拉伯糖和半乳糖，分別為9.43%和3.37%，表明WSP是由葡聚糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖組成的[8-9]。然而，在WSP中并沒有檢測到葡萄糖醛酸，表明葡萄糖醛酸很難通過熱水抽提法從植物原料中提取出來[10]。盡管WSP是提取過程中的重要多糖之一，但它主要含有葡萄糖，并且在本實驗提取條件下得率僅為0.49%。因此，本研究將重點考察梯度乙醇分級沉淀法提取的堿溶性木聚糖組分。

梯度乙醇分級沉淀法分離得到的木聚糖組分中，糖成分主要包括43.96%～63.73%的木糖、10.89%～23.18%的阿拉伯糖、8.35%～17.47%的葡萄糖和5.01%～20.16%的半乳糖，而含葡萄糖醛酸僅為0.4%～3.14%。葡萄糖來自葡糖醛酸阿拉伯木聚糖和木葡聚糖，而半乳糖來自阿拉伯半乳聚糖，少量的葡萄糖醛酸可能是4-O-甲基葡萄糖醛酸以支鏈的形式存在[11-14]。木質(zhì)素的含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，說明分級沉淀的過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，木質(zhì)素含量也就越高。采用不同的干燥方式進行干燥時，只要分級沉淀時乙醇的體積分?jǐn)?shù)相同，其沉淀下來的木聚糖具有類似的化學(xué)組成，這表明干燥方式對木聚糖各級分的組成影響較小。通常采用阿拉伯糖與木糖的比率來表示木聚糖聚合物的線性或支化程度[15]。由表1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)從20%增加到75%，采用冷凍方式干燥的木聚糖中w(阿拉伯糖)/w(木糖)從0.19增加至0.51，說明隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，更多支化的木聚糖被沉淀出來，即較高體積分?jǐn)?shù)的乙醇有利于支化木聚糖的析出，也就是說，可以在較低乙醇體積分?jǐn)?shù)下回收線性木聚糖，而在較高乙醇體積分?jǐn)?shù)下獲得更多支鏈木聚糖。同樣地，采用真空干燥方式干燥的木聚糖級分也具有類似的變化趨勢。

表1 梯度乙醇沉淀法制備低分散度木聚糖的單糖組成

1)WSP:水溶性多糖water-soluble polysaccharide;D:冷凍干燥freeze-dried;H:真空干燥oven-dried

2.3 木聚糖的分析與表征

2.3.1FT-IR分析 梯度乙醇分級沉淀法獲得的木聚糖的FT-IR如圖2所示。

a. 冷凍干燥freeze-dried; b. 真空干燥oven-dried圖2 不同干燥方式時由梯度乙醇沉淀法制備的木聚糖的FT-IR圖Fig.2 FT-IR spectra of xylan by graded ethanol precipitation with different dry methods

在3362和2882 cm-1處的強吸收峰分別為O—H伸縮振動和C—H伸縮伸展[16]。1606 cm-1為H—O—H角振動，歸因于支化和水合程度，說明化合物中存在結(jié)合水[10]。1375 cm-1的弱吸收帶為C—H伸縮振動。1249 cm-1處的弱吸收峰與O—H或者C—O彎曲振動有關(guān)[17]。D75、H75、D60和H60在波數(shù)1508 cm-1附近出現(xiàn)弱吸收，為木質(zhì)素的芳環(huán)振動吸收峰[18]。在1164 cm-1有弱吸收，表明側(cè)鏈存在阿拉伯糖基。1036 cm-1處的吸收峰為半纖維素的特征吸收，為醚鍵(C—O—C)的伸縮振動[16]。895 cm-1處有較強的吸收峰，為C1—H彎曲振動，屬于β-D-木糖的特征結(jié)構(gòu)，表明糖單元之間以β-糖苷鍵連接。由圖2(a)和(b)對比可知，干燥方式不會改變物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，特征官能團不變，所以說二者作用是相同的。

2.3.2核磁共振分析 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%的溶液中沉淀獲得的木聚糖(D10)通過1H NMR分析表征其結(jié)構(gòu)特征，見圖3(a)。在δ4.76處的強信號峰是由殘留溶劑(D2O)引起的。δ3.0～4.3之間的主要信號是由吡喃型木糖單元引起的，是其特征信號峰，說明梯度乙醇沉淀法提取玉米芯得到的多糖主要成分為木聚糖。其中δ4.23為H-1信號峰，δ3.88為與C-5相連的平伏鍵上的H的峰，δ3.567為H- 4信號峰，δ3.29為H-3信號峰，δ3.20為與C-5相連的直立鍵上的H的峰，δ3.10為H-2信號峰。δ5.09 的信號峰為通過C-3和C-2(二取代)與木糖骨架相連接的L-呋喃阿拉伯糖端基的異頭質(zhì)子[19-20]。木聚糖D30的1H NMR光譜(圖3(b))與之類似。

1H NMR: a. D10; b. D30; 13C NMR: c. D10; d. D30圖3 不同樣品的1H NMR和13C NMR圖Fig.3 1H NMR and 13C NMR spectra of different samples

為更深入了解木聚糖的分支結(jié)構(gòu)，對D10和D30進行13C NMR分析。D10的13C NMR譜(圖3(c))顯示有δ105.06(C-1)、78.58(C- 4)、77.70(C-3)、76.04(C-2)和65.99(C-5)5個主要信號峰，為(1→4)-β-D-吡喃木聚糖。δ83.07和89.07為連接在α-D-木聚糖上的α-L-阿拉伯呋喃糖殘基。δ112.14對應(yīng)(OCH3- 4)4-O-甲基-α-D-葡糖醛酸[21]。D30的13C NMR光譜(圖3(d))也呈現(xiàn)出類似的一般特征。以上結(jié)果表明，通過梯度乙醇沉淀法提取玉米芯得到的多糖主要為L-阿拉伯糖-(4-O-甲基-D-葡糖醛酸)木聚糖。

2.3.3TG分析 梯度乙醇分級沉淀法制備的低分散度木聚糖的TG、DTG曲線如圖4所示。通過觀察各個級分的熱重曲線可知，D30在230 ℃左右出現(xiàn)明顯的熱損失峰，D45在116、130 ℃出現(xiàn)熱損失雙峰，D60在100～300 ℃連續(xù)出現(xiàn)4重?zé)釗p失峰。H30在200 ℃左右出現(xiàn)明確的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)，H45在123 ℃左右出現(xiàn)Tg，H75則逐步降解。該現(xiàn)象說明D45、D60由2～4種不同的分子鏈段構(gòu)成，D75更接近于體型高聚物降解曲線。根據(jù)表1各級分組成分析，造成以上差異的主要原因可能是級分中分子鏈段組成不同；木質(zhì)素含量的差異，支化度不同，其中H75支化程度最高；阿拉伯糖含量明顯高于前3種級分。各級分的熱穩(wěn)定性分析，為后續(xù)改性反應(yīng)對糖級分的選擇提供了參考。

冷凍干燥freeze-dried: a. TG; c. DTG真空干燥oven-dried: b. TG; d. DTG圖4 不同干燥方式時由梯度乙醇沉淀法制備的低分散度木聚糖的TG和DTG曲線Fig.4 TG and DTG curves of low dispersion xylan from corncob by graded ethanol precipitation with different dry methods

2.3.4相對分子質(zhì)量分析 通過凝膠滲透色譜法(GPC)測定梯度乙醇沉淀法提取木聚糖的Mw、Mn和D(Mw/Mn)，結(jié)果見表2。由表2可知，通過冷凍干燥得到的木聚糖的Mw在108 533至197 752之間，而真空干燥的木聚糖的Mw在41 231至47 242之間。這是由于在干燥過程中脫水方式的不同造成的，在真空干燥中木聚糖糖鏈隨水分蒸發(fā)而發(fā)生斷裂，導(dǎo)致相對分子質(zhì)量下降；而冷凍干燥直接通過冰升華除去水分，有利于保持木聚糖的原始結(jié)構(gòu)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從10%增加到20%時，Mw明顯減小。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時，得到了相對分子質(zhì)量最小的木聚糖。但是，當(dāng)進一步提高乙醇體積分?jǐn)?shù)時，無論是真空干燥還是冷凍干燥得到的木聚糖的Mw和Mn均有所增加。此外，通過梯度乙醇沉淀法得到的木聚糖的D值均較小，除H60外，其他級分均小于1.5，從而導(dǎo)致更窄的相對分子質(zhì)量分布，表明各梯度下得到的木聚糖的結(jié)構(gòu)均勻，化學(xué)性質(zhì)相似。由此可以得出，梯度乙醇分級沉淀法制備得到了多分散性指數(shù)小、相對分子質(zhì)量分布窄的低分散度木聚糖，可以作為木聚糖衍生化學(xué)品和醫(yī)藥用品的原材料。

表2 梯度乙醇沉淀法得到的木聚糖的Mw、Mn和D(Mw/Mn)

3 結(jié) 論

3.1以玉米芯為原料，采用堿性過氧化氫溶液提取半纖維素，通過單因素試驗考察了不同條件對玉米芯木聚糖提取得率的影響，得到最佳的提取條件為在1%H2O2，5%NaOH的堿性過氧化氫溶液中，反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間16 h、液固比為20∶1(mL∶g)，木聚糖得率為83.15%。

3.2采用梯度乙醇分級沉淀法對堿性過氧化氫提取的木聚糖進行分級分離，經(jīng)離子色譜、FT-IR、NMR和TG分析可知，不同梯度沉降下來的各級分具有相似的糖組成，主要由L-阿拉伯-(4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸)木聚糖構(gòu)成。

3.3冷凍干燥的木聚糖Mw為108 533～197 752，真空干燥的木聚糖的Mw為41 231～47 242；并且各級分的木聚糖多分散系數(shù)均較小(1.172～1.517)，其中11種樣品均小于1.5，為相對分子質(zhì)量分布窄的低分散度木聚糖。