甜瓜全基因組R2R3MYB轉錄因子基因的識別與分析

張爽爽 陳 瑩 張金鵬 耿 偉 王利波 惠長敏*

（吉林省蔬菜花卉科學研究院 130033）

MYB轉錄因子是廣泛存在于植物基因組內的一類基因家族，參與植物生長發育及抵御生物或非生物脅迫等生理過程[1、2、3]。

MYB蛋白以含有一段保守的DNA結構域為共同特征，DNA結構域內含有1～4個串聯的、不完全重復的MYB重復區域，根據含有的MYB重復區域數目的不同可將MYB蛋白分為4個亞類：第一亞類是R1/R2-MYB，該亞類的特征是含有一個R或含有兩個R但間隔較遠的MYB-related；第二亞類是含有兩個R的R2R3MYB；第三亞類是含有三個R的3R-MYB又叫pc-MYB；第四亞類是含有四個類似R1/R2結構域的4R-MYB，該亞類在植物基因組中存在數目較少，只在個別植物中有報道[4、5]。

目前研究較多的是R2R3MYB，這一亞類的MYB基因廣泛地參與植物體的苯丙烷類物質代謝調控[5、6、7、8]、細胞周期循環調控[9、10、11]以及對逆境脅迫做出應答等生理活動[12、13]。

R2R3MYB在植物基因組中數量較多，據報道擬南芥基因組中有137個[4]、玉米基因組中有158個[14]、大豆基因組中有244個[15]、蒺藜苜蓿基因組中91個[15]、葡萄基因組中122個[15]、水稻基因組中有103個[15]。

2012年甜瓜基因組數據已經公布[16]，但是對甜瓜全基因組中的R2R3MYB轉錄因子的研究還未見報道。

本研究以甜瓜基因組為研究對象，利用已知的R2R3MYB基因的結構域進行BLASTP檢索，發掘甜瓜中的R2R3MYB基因，利用生物信息學軟件對其蛋白結構域、保守基序等進行分析，并與擬南芥R2R3MYB轉錄因子構建親緣進化樹，以期對甜瓜中R2R3MYB基因的功能進行初步的預測。

1 材料及方法

1.1 R2R3MYB轉錄因子的搜集

利用擬南芥基因組中R2R3MYB蛋白的結構域序列在MELONOMICS數據庫中進行Blastp搜索，獲取甜瓜基因組中R2R3MYB轉錄因子的基因編號、蛋白序列及開放閱讀框序列等信息，刪除重復和不完全序列；利用SMART和EXPASY數據庫對獲取的R2R3MYB蛋白的結構域進行分析和鑒定，刪除不具有典型結構域的序列，將這些數據作為原始數據進行保存。

1.2 R2R3MYB轉錄因子的生物信息學分析

利用MAFFT在線軟件進行多重序列比對，輸入氨基酸序列后設置默認參數；利用MEME在線軟件對甜瓜中R2R3MYB蛋白的保守基序進行分析，參數設置如下：最大基序數50、基序最長氨基酸個數200、基序最短氨基酸個數6，其他參數為默認設置；使用 MEGA6.0構建系統發育樹，采用鄰接法（NJ），bootstrap analysis設置為1000次。

2 結果與分析

2.1 R2R3MYB轉錄因子的鑒定

利用擬南芥基因組中137個R2R3MYB蛋白的結構域序列在甜瓜數據庫中進行搜索，共得到73個R2R3MYB轉錄因子基因，利用EXPASY和SMART在線軟件分別對獲取的R2R3MYB蛋白的結構域進行分析和鑒定，其中有3個基因不具有R2R3MYB蛋白典型結構域，刪除這3條序列，最后得到了70個具有R2R3MYB蛋白典型結構域的基因，分別命名為MYB1-MYB70，蛋白序列中氨基酸的個數為166-553個不等（詳見表1）。

2.2 生物信息學分析

為了解甜瓜R2R3MYB基因結構域的特征及其中重要的氨基酸位點，我們首先進行多序列比對，如圖1所示，從序列比對結果可以發現甜瓜R2R3MYB保守區域含有108個氨基酸，只有個別的序列存在缺失和插入；第一個MYB重復區域含有3個保守的色氨酸殘基（W），第二個MYB重復區域內某些保守的色氨酸殘基（W）被亮氨酸（L）、異亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）等取代，這種現象在其他物種中也存在，可能與植物進化過程有關[15]。

我們進一步通過MEME軟件對70個R2R3MYB基因的保守基序進行了分析，如圖2所示，甜瓜R2R3MYB基因含有多個保守的基序，這些保守基序的存在與該基因發揮的功能相關。

為了對甜瓜中R2R3MYB基因的功能進行初步的預測，我們將甜瓜中R2R3MYB基因與擬南芥中的R2R3MYB基因共同構建系統進化樹，如圖3所示，根據文獻報道的擬南芥R2R3MYB基因亞家族的劃分，本文中將甜瓜R2R3MYB基因劃分為27個亞家族[4]，結果如表2所示，根據擬南芥亞家族中R2R3MYB基因的功能初步預測甜瓜中R2R3MYB基因可能發揮的作用。

表1 甜瓜中R2R3MYB基因的蛋白序列號及結構域分析

圖2 甜瓜中R2R3MYB基因的保守基序分析

圖3 甜瓜與擬南芥中R2R3MYB基因的親緣進化樹

表2 甜瓜中的R2R3MYB基因亞組的劃分

3 討論

R2R3MYB基因在植物基因組中數量較多，本研究在甜瓜基因組中發掘70個R2R3MYB基因，占甜瓜總轉錄因子數的5%，這也說明R2R3MYB基因在甜瓜生長發育過程中發揮著重要的作用。MYB轉錄因子的每個MYB的重復區域中含有3個高度保守的色氨酸殘基（W），MYB蛋白發揮功能時氨基酸會折疊成螺旋-轉角-螺旋（HTH）的形式參與DNA大溝的結合，保守的色氨酸殘基起著疏水的作用，對維持HTH的構型有著特別重要的意義[4]。本研究中發現甜瓜R2R3MYB基因的第一個MYB重復區域含有3個保守的色氨酸殘基（W），但是第二個MYB重復區域內的保守的色氨酸殘基（W）被亮氨酸（L）、異亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）等取代，通過查找文獻發現這種現象在其他物種中也存在，這可能與植物進化過程有關[15]。

為了發掘甜瓜基因組中存在的進化過程中功能保守的R2R3MYB基因，我們將甜瓜中R2R3MYB基因與擬南芥中的R2R3MYB基因共同構建親緣關系進化樹，并通過劃分亞組初步預測其功能。例如在SG8中，AtMYB42和AtMYB85被證明在擬南芥中參與木質素生物合成代謝調控[17]，甜瓜中MYB54和MYB56在親緣進化樹中表現出進化關系較近，若這類基因在進化過程中功能保守，甜瓜中MYB54和MYB56也可能參與木質素生物合成代謝調控。我們的研究初步預測了甜瓜中可能參與苯丙烷類物質代謝、生物及非生物脅迫反應的R2R3MYB基因，為后續基因功能的研究奠定基礎。