超保守RNA uc. 189在大腸癌組織中的表達及臨床病理意義

鄧 慧, 李鑫雨, 吳燕丹, 王成海, 3

(1. 揚州大學醫學院(轉化醫學研究院), 江蘇 揚州, 225009; 2. 揚州大學醫學院附屬揚州洪泉醫院 病理科, 江蘇 江都, 225200; 3. 江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室, 江蘇 揚州, 225009)

大腸癌是成年人消化系統最為常見的惡性腫瘤之一，多見于肥胖患者，包括結腸癌和直腸癌。在大腸癌的病理學分型中，腺癌占絕大多數，而鱗癌發生比例較低，常位于直腸肛門附近。超保守RNA(UCR)是一群絕對高度保守的長鏈非編碼RNA, 廣泛存在于不同生物物種中，如人、兔、鼠類等生物[1-3]。有趣的是，雖然生物物種不一樣，但所攜帶的超保守RNA基因序列卻高度一致。目前有許多研究[4-6]表明，超保守RNA參與了諸多生物學功能，影響正常細胞或腫瘤細胞的增殖、細胞周期、細胞凋亡和侵襲轉移。本研究采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測超保守RNA uc.189在大腸癌及相應的癌旁正常組織中的表達水平，分析uc.189的RNA表達水平與大腸癌病理參數的相關性，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

130例大腸癌及配對的癌旁正常組織標本均來源于揚州大學附屬醫院普外科手術患者，采集時間為 2017年1月—2018年12月，患者年齡35～72歲，中位年齡為58歲; 男79例，女51例。所有患者手術前未經過放療、化療等處理。標本采集、使用及臨床資料的整理均經揚州大學附屬醫院倫理委員會批準，并與患者簽署知情同意書。新鮮大腸癌組織采集后立即放入液氮罐里，于-80 ℃冰箱內長期保存。病理組織學類型包括腺癌122例，鱗狀細胞癌8例; TNM分期包括Ⅰ期10例, ⅡA期16例, ⅡB期27例, ⅢA期46例, ⅢB期26例, Ⅳ期5例。

1.2 引物設計與合成

uc.189與內參U6的PCR引物序列由本實驗組設計提供，引物序列的合成購自上海生工生物工程有限公司。引物序列如下: uc.189-上游引物: 5′-CAGAGTCACCATCATGTCTC-3′; uc.189-下游引物: 5′-AAGGCTGCTGCTGTAGTTGT-3′; U6-上游引物: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′; U6-上游引物: 5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3′。

1.3 樣本總RNA萃取

步驟如下: ① 首先取0.10～0.15 g新鮮腫瘤組織，放置在預冷的研缽里研磨成細粉狀。② 將細粉樣組織加入至含有1 mL TRizol的離心管中。③ 室溫下用力振蕩15 min, 使組織充分裂解，靜止數秒。④ 4 ℃離心10 min, 轉速12 000轉/min。⑤ 將上一步的上清液迅速加入200 μL氯仿，快速振蕩120 s, 并在室溫下不斷振蕩約5 min, 靜置120 s。⑥ 4 ℃離心10 min, 轉速12 000轉/min。⑦ 將上一步上清液迅速加入500 μL 異丙醇后置于新的離心管內，緩慢顛倒離心管并沉淀20 min。⑧ 4 ℃離心10 min, 轉速12 000轉/min, 棄上清液。⑨ 在離心固態物質中加入1 mL 75%酒精并緩慢顛倒棄上清，再加入1 mL 75%酒精使沉淀物質懸浮, 4 ℃離心5 min, 轉速10 000轉/min, 棄上清。⑩ 自然干燥2 min, 加入10 μL經焦碳酸二乙酯(DEPC) 處理的雙蒸水溶解。總RNA提取后檢測光密度OD值，記錄后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 cDNA合成

購買并使用Takara生物工程公司逆轉錄反應試劑盒獲取cDNA。反應體系共20 μL, RNA約50 ng, 5×PrimeScript Buffer 4 μL, PrimeScript RT EnzymeMix I 1 μL, 上下游引物各0.5 μL, 添加RNase-Free water 調整體系至20 μL。反應條件37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s, 反應產物保存于4 ℃冰箱。

1.5 qRT-PCR

購買并使用Takara生物公司qRT-PCR反應試劑盒，反應體系為20 μL。cDNA為1 μL, 12×SYBR Premix ExTaqTMII 10 μL, 上下游引物各0.5 μL, 加RNase-Free water調整體系至20 μL, 每組樣本有3個復孔, U6設置為內參; 具體實驗操作在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system儀器上進行。最后讀取定量PCR反應Ct值，計算2-ΔΔCt(ΔCt=Ct(uc.189)-Ct(U6), uc.189的相對表達量以2-ΔΔCt計)。

1.6 統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0統計分析及作圖軟件進行相關分析。以均數±標準差表示兩樣本間的差異，采用單因素方差分析比較uc.189在不同臨床病理特征中的表達差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 uc.189在大腸癌組織中的相對表達

qRT-PCR實驗結果表明, 130例大腸癌組織中uc.189的表達為(3.323±1.304), 高于癌旁正常大腸組織中的(1.020±0.685), 差異有統計學意義(t=21.648，P<0.05)。見圖1。

與癌旁正常腸組織比較, ?P<0.05圖1 uc.189在大腸癌中的相對表達

2.2 uc.189在大腸癌組織中的表達與臨床病理特征的關系

在130例大腸癌組織中, uc.189高表達者112例(RNA相對表達量>1), 低表達或正常表達者18例(RNA相對表達量≤1), 而uc.189表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移和腫瘤TNM分期均有顯著相關性(P<0.05), 與年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度和遠處轉移均無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 大腸癌組織中uc.189表達與臨床病理特征的相關性

3 討 論

大腸癌是人類消化系統常見的惡性腫瘤，包括結腸癌和直腸癌。高脂、高蛋白和低纖維飲食是引發大腸癌的易感因素，其他因素包括遺傳、大腸炎癥、大腸腺瘤等。大腸癌在全世界的癌癥發病率中占第3位，在中國則占第5位，并且發病率呈上升趨勢，尤其是結腸癌的發病率增長速度迅猛[7-9]。

超保守RNA是長鏈非編碼RNA分子，其堿基序列大于200個。文獻[1-3]報道超保守RNA有483個，包括正鏈DNA 483個和反鏈DNA 483個[10], 其廣泛存在于人、兔、小鼠和大鼠等高等生物中，其DNA序列絕對保守相同。可轉錄成RNA分子的超保守RNA, 能調控mRNA的轉錄和翻譯，影響蛋白質的合成，同時也能調控其他的RNA分子而影響相關的生物學功能等，從而進一步調控腫瘤細胞的增殖與分化、侵襲轉移與預后，參與腫瘤的發生、發展等過程[4-6]。

目前，超保守RNA對腫瘤發生、發展的影響已經成為腫瘤研究的新熱點，國外文獻[11-16]已對超保守RNA在肺癌、腎細胞癌、肝癌、白血病和膠質瘤等腫瘤中的作用開展了大量的研究。uc.189是383個超保守RNA(UCRs)的一種，其在肝癌組織中高表達[16]。對于uc.189在大腸癌中的研究還未見文獻報道，對其在大腸癌中的表達及生物學功能尚不明確。本研究采用qRT-PCR技術發現大腸癌組織中uc.189高表達，約占86.2%(112/130), 而在18例患者中uc.189是正常表達和低表達，證實uc.189在130例大腸癌組織中的表達量顯著高于癌旁正常組織中的表達量(P<0.05), 提示uc.189可能是一種新的腫瘤癌基因，極有可能參與了大腸癌的發生、發展過程。本研究結果還表明，大腸癌患者uc.189表達越高，則腫瘤的分化程度越低、淋巴結容易發生轉移以及TNM分期越高，提示uc.189表達越高，患者的預后就越差, uc.189的表達在大腸癌的早期診斷和預后評估中具有一定的參考價值。

總之，本研究表明大腸癌中uc.189的表達高于相鄰的正常大腸組織，其高表達與大腸癌的分化程度、淋巴結轉移和TNM分期密切相關, uc.189可能會作為大腸癌的一種新的腫瘤標志物。