基于賴氨酸修飾膠體金的花生黃曲霉毒素B1檢測

黃星奕 葉偉濤 王成全 呂日琴 孫兆燕

(江蘇大學食品與生物工程學院， 鎮江 212013)

0 引言

花生是我國產量豐富、食用廣泛的一種堅果[1]。在夏季高溫、高濕情況下，花生易發生霉變，在霉變過程中會產生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、黑曲霉毒素等霉菌毒素[2-4]。研究表明，在所有已知的霉菌毒素中，黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)的毒性、致畸性、致癌性均居于首位，其半數致死量(LD50)為0.294 mg/kg[5]。我國對農產品中AFB1含量具有嚴格的限制，規定花生及其制品中AFB1的含量(質量比)不得超過20 μg/kg[6]。農產品中AFB1的檢測，對于減少霉菌毒素的危害具有重要的意義。

傳統的霉菌毒素檢測方法主要有生物學檢測法、薄層分析法、高效液相色譜法等[7]，由于這些方法操作復雜、預處理繁瑣、處理時間長，研究者正不斷開發新的檢測方法[8]。納米材料由于其量子尺寸效應，表現出與其他傳統材料不同的特性，如光學性質、磁學性質、光催化作用等[9-11]，國內外學者嘗試使用納米材料檢測霉菌毒素。文獻[12]利用AFB1抗體包被納米金，制備了可用于小麥粉中AFB1快速檢測的新型安培免疫傳感器，檢測限為0.3 μg/L。文獻[13]通過合成的納米粒子與黃曲霉毒素人工抗原抗體的競爭免疫結合，實現了新型的AFB1檢測方法，檢測限為0.03 ng/mL。文獻[14]利用納米粒子建立了一種OTA(赭曲霉毒素A)檢測體系，通過溶液中游離的cDNA與加入的Ag+在NaBH4的存在下形成強熒光的納米粒子，從而實現OTA的檢測，檢測限為2 pg/mL。文獻[15]以磁性材料為載體，不同納米材料為信號探針，構建磁控適配體比色、熒光、電化學傳感體系，成功檢測出花生中赭曲霉毒素A和伏馬毒素B1。

傳統的膠體金標記技術的實驗步驟較為繁瑣，需要構建人工抗原抗體，從而實現標記[16]。本文以膠體金為介質，制備賴氨酸修飾的金膠體系，以實現對霉變花生中AFB1的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器

UV-2450型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；JEOL 2100型透射電鏡(日本JEOL公司)；LA-20型高效液相色譜儀(日本島津公司)，配有熒光檢測器；11830-RT型氮吹儀(美國Organomation公司)；DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器(河南鞏義市予華儀器廠)；TG16-WS型臺式高速離心機(長沙湘儀有限公司)；XH-D型漩渦振蕩器(無錫杰瑞安儀器設備有限公司)。

1.2 試劑

AFB1、OTA、FB1(伏馬毒素B1)、氯金酸(HAuCl4)、檸檬酸三鈉，購于Sigma-Aldrich公司；L-賴氨酸、三氟乙酸、正己烷，購于薩恩化學技術有限公司；HgCl2，購于山東西亞化學股份有限公司；乙腈，購于美國TEDIA公司；試驗用水為二次去離子水。

1.3 賴氨酸修飾的膠體金制備

本實驗采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[17]，首先，稱取8.9 mg的氯金酸固體粉末溶于100 mL的超純水中，加熱到沸騰，迅速加入12 mL的1%檸檬酸三鈉溶液，持續加熱。觀察溶液的顏色變化，當溶液的顏色完全變為透明、澄清的酒紅色時，停止加熱。待溶液冷卻至室溫(20℃)，4℃避光保存[18]。然后將5 mL的15 mol/L賴氨酸水溶液加入45 mL所制備的AuNPs(膠體金)中，150 r/min攪拌10 min，制備得到賴氨酸修飾的膠體金(Lys-AuNPs)溶液。利用紫外可見分光光度計和透射電鏡對其進行表征。

1.4 AFB1測定原理與方法

Hg2+能夠與AFB1形成穩定的螯合物。Hg是過渡金屬元素，并且容易形成配位數為6的絡合物。它的幾何構型通常相當于由6個配位原子形成的八面體，使得配合物AFB1-Hg2+的共軛平面增強，剛性結構增加[19]。

本實驗通過檸檬酸三鈉還原HAuCl4制得膠體金，生成的溶液是一種膠體溶液，Lys-AuNPs粒子的表面覆蓋著賴氨酸，顆粒之間通過靜電排斥作用使得賴氨酸修飾的膠體金溶液保持著穩定性[20]。如圖1所示，當溶液中加入HgCl2時，Hg2+會與賴氨酸上的氨基發生作用，破壞膠體溶液的穩定性，使溶液產生凝聚，顏色變成灰黑色。當溶液中混入AFB1，則Hg2+會與AFB1發生螯合反應，生成穩定的配合物，從而使破壞膠體溶液穩定性的Hg2+減少，隨著AFB1濃度的升高，溶液中游離的Hg2+不斷減少，顏色逐漸變為紅色。通過紫外可見分光光度計對溶液進行吸光度測定，然后建立AFB1濃度與吸光度之間的相關關系。

圖1 賴氨酸修飾的膠體金溶液檢測AFB1原理示意圖Fig.1 Schematic of AFB1 detection by lysine-functionalized gold nanoparticles

在5 mL的離心管中加入15 μmol/L的HgCl2溶液100 μL和不同濃度的AFB1900 μL，漩渦振蕩3 min，混勻。在混合液中加入1 mL的Lys-AuNPs溶液，漩渦振蕩5 min。用紫外可見分光光度計測其吸收光譜，根據在725 nm和525 nm處吸光度比值建立AFB1濃度的校準曲線。

1.5 花生樣本的制備

本批次實驗花生仁樣本均產于江蘇省南通市，品種為冀花4號，并參考GB 5009.22—2016的方法進行預處理。首先，將花生樣品研磨成粉末，稱取0.5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中。再加入20 mL質量分數25%的乙腈，漩渦混勻。然后用均質機均質3 min，在6 000 r/min下離心10 min，取其上清液備用。

1.6 AFB1的高效液相色譜法測定

色譜條件：流動相為25%乙腈；色譜柱為C18柱；流速1.0 mL/min；柱溫40℃；進樣體積50 μL；檢測波長360 nm；發射波長440 nm。

柱前衍生：用移液管吸取4 mL的待測液于10 mL的離心管中，然后在50℃下用氮氣慢慢地吹至近干，再加入200 μL的正己烷與100 μL的三氟乙酸，漩渦振蕩30 s。在40℃的恒溫箱中衍生15 min，在50℃下用氮氣緩緩地吹至近干。用25%乙腈定容至1 mL，漩渦振蕩30 s溶解殘留物，最后過0.45 μm濾膜，收集濾液于進樣瓶中備用。

2 結果與討論

2.1 Lys-AuNPs溶液的表征與分析

將制備得到的賴氨酸修飾的膠體金溶液在透射電鏡下進行觀察，Lys-AuNPs的粒徑大約為25 nm，圖2為膠體金溶液在不同狀態下的電鏡圖，圖2a為賴氨酸修飾的膠體金溶液，顆粒間分散性良好；圖2b中顆粒之間發生凝聚現象；圖2c中顆粒之間又重新分散開。如圖3所示，從紫外可見光譜圖中可以發現Lys-AuNPs溶液僅在525 nm處存在一個吸收峰；當溶液中加入Hg2+時，溶液顏色會變成灰黑色，且溶液發生凝聚現象，會在525 nm和725 nm處形成2個吸收峰；當溶液中加入Hg2+和20 ng/mL的AFB1時，溶液在525 nm處的吸光度增加，在725 nm處的吸光度減小。

圖2 膠體金溶液不同狀態下的透射電鏡圖Fig.2 TEM images of different states of gold nanoparticles solution

圖3 溶液中加入Hg2+和AFB1后Lys-AuNPs的紫外可見光譜Fig.3 UV-visible spectra of gold nanoparticles solution after adding Hg2+ and AFB1

2.2 梯度實驗

在Lys-AuNPs和Hg2+離子濃度一致的情況下，向體系中加入不同質量濃度(0、1、2.5、5、10、20、50、100、300、400、500 ng/mL)的AFB1溶液，混勻、平衡后觀察其在不同質量濃度AFB1下Lys-AuNPs溶液的顏色變化和凝聚情況，并用紫外可見分光光度計測量混合后溶液的吸光度，其紫外可見光譜圖如圖4所示。

圖4 溶液在不同AFB1質量濃度下的紫外可見光譜Fig.4 UV-visible spectrogram of different concentrations of AFB1

圖5 溶液在不同AFB1質量濃度下的顏色Fig.5 Color of solutions with different concentrations of AFB1

當AFB1的質量濃度發生變化時，溶液的顏色也會產生相應的變化，如圖5所示。當溶液中沒有混入AFB1，只有Lys-AuNPs和Hg2+時，溶液呈灰黑色，此時溶液在525 nm處和725 nm處有兩個吸收峰；隨著AFB1質量濃度的不斷增加，溶液的顏色由灰黑色逐漸變淡，最后向紅色轉變，Lys-AuNPs溶液在525 nm處的吸光度緩慢下降，而725 nm處的吸光度不斷增加；當溶液中Hg2+全部與AFB1形成配合物時，溶液顏色變為紅色，此時，紫外可見光譜圖中只剩下一個吸收峰。觀察溶液在525 nm和725 nm處雙峰吸光度與AFB1濃度之間的關系可知，Lys-AuNPs溶液在725 nm處的吸光度A725與在525 nm處的吸光度A525之間的比值A725/A525隨著AFB1質量濃度的增加而減小，逐漸趨向0。通過分析Lys-AuNPs溶液中AFB1質量濃度與A725/A525的相關關系發現，當溶液中AFB1質量濃度在1～50 ng/mL時，A725/A525與AFB1質量濃度有較好的線性關系，如圖6所示，線性回歸方程為y=-0.010 5x+1.144 7，決定系數R2=0.996，檢出限為0.2 ng/mL。

圖6 A725/A525與AFB1質量濃度之間的關系Fig.6 Relationship between concentration of AFB1 and A725/A525 value

2.3 回收率和相對標準偏差

選取正常花生將其研磨成粉末，在50 mL的離心管中稱取4份花生粉末，每份0.5 g，將等體積不同質量濃度的AFB1(0.5、1、10、50 ng/mL)，加入20 mL的50%乙腈，漩渦混合，用均質機均質3 min，在6 000 r/min下離心10 min。然后利用Lys-AuNPs溶液測AFB1的質量濃度，得其加標回收率分別為85.0%、97.2%、110%、95.5%，平均加標回收率為96.9%，相對標準偏差為8.9%。

2.4 Lys-AuNPs溶液的特異性

為了研究本實驗中制備的Lys-AuNPs溶液的特異性，通過選用霉變花生仁中其它霉菌毒素，如OTA和FB1作為干擾霉菌毒素，進行驗證。取900 μL質量濃度為5 ng/mL的AFB1、OTA、FB1分別加入3支10 mL的離心管內，在離心管中分別加入15 μmol/L的HgCl2溶液100 μL，漩渦振蕩3 min，使其充分混合。然后在每個離心管的混合液中分別加入1 mL的Lys-AuNPs溶液，漩渦振蕩5 min，并用紫外可見分光光度計測其吸收光譜。圖7為分別加入AFB1、FB1、OTA后的紫外可見光譜圖，與空白組相比，加入5 ng/mL AFB1的溶液在525 nm處的吸光度明顯上升，725 nm處的吸光度顯著降低，而加入OTA與FB1的溶液的吸光度幾乎沒有變化。數據表明，目標物中混入AFB1時的吸光度變化率遠高于混入OTA與FB1。由以上結果表明，此方法所構建的賴氨酸修飾的膠體金體系有較好的選擇性，霉變花生仁中存在的OTA和FB1并不會影響AFB1質量濃度的檢測，基于此建立的花生仁中AFB1含量的檢測方法具有良好的特異性。

圖7 AFB1、FB1、OTA的紫外可見光譜Fig.7 UV-visible spectrogram of AFB1, FB1 and OTA

2.5 AFB1含量的高效液相色譜法測定

用本研究提出的Lys-AuNPs溶液檢測AFB1的方法檢測溶液中AFB1的質量濃度，并用高效液相色譜法(HPLC)對AFB1的質量濃度進行驗證。選取40個花生樣品對其AFB1質量濃度進行測定與比較，由圖8可知，用高效液相色譜法和Lys-AuNPs溶液測定的AFB1質量濃度的均方根誤差為0.865 1 ng/mL，相關系數為0.996 1。結果表明由本實驗所建立的賴氨酸修飾的膠體金體系可用于花生中AFB1的檢測。

圖8 用Lys-AuNPs和HPLC測定AFB1濃度的比較Fig.8 Comparison of results for AFB1 concentration determined by Lys-AuNPs and HPLC methods

3 結束語

提出了一種新的霉變花生中AFB1檢測方法：用賴氨酸修飾的膠體金溶膠體系對霉變花生中AFB1進行檢測。該方法無需使用光敏材料、酶試劑等，具有快速、簡單、特異性好等優勢，并且無需制備復雜的特異性抗體來檢測黃曲霉毒素。Lys-AuNPs溶液檢測AFB1的線性范圍為1～50 ng/mL，決定系數0.996，檢出限為0.2 ng/mL，平均加標回收率為96.9%，相對標準偏差為8.9%。該方法快速、準確、靈敏，可用于霉變花生中AFB1的檢測。