基于二氨基熒光素類熒光探針的新型一氧化氮檢測方法

王成強，張 玲

（上海理工大學 光電信息與計算機工程學院，上海 200093）

引 言

一氧化氮(NO)作為普遍存在于脊椎動物各種細胞中的一種無機分子，參與機體內多種生理過程，如血管平滑肌的舒張、免疫防御的調節以及中樞和自律神經的傳導等，在生理學、病理學以及藥理學中均發揮著廣泛的作用[1-3]。因此，近年來對于NO的檢測受到越來越多研究者的重視，但由于其化學性質活潑，半衰期短且生理環境下其質量分數變化范圍很大，因此，在NO檢測中既需要較寬的檢測范圍，也需要極快的響應時間[4-5]。

現有檢測NO的方法有多種，如：利用NO與金屬蛋白、金屬指示劑或重氮反應，根據前后吸收光譜的變化來檢測的光譜法[6]；利用NO的孤對電子自由基特性的電子順磁共振波普法(EPR)[7]；根據NO與O3或H2O2反應的化學發光法[8]；利用NO被氧化成的反應來檢測NO的電化學法[9]；直接與 NO反應或者與NO分解的副產物反應產生熒光的改變來實現檢測的熒光檢測法[10]等等。不同NO檢測方法應用于不同的分析領域，與其他技術相比，熒光檢測法具有較好的靈敏度、時空分辨率、選擇性和可操作性[11]。科學家們已經研究出諸多用于NO檢測的熒光探針，近年其中一種新型二氨基熒光素類NO探針DAF-FM(4-amino-5-methylamion-2'，7'-difluorofluorescein)得到了廣泛應用。相對于之前常用的DAF-2熒光探針，DAF-FM在多方面表現出更好的性能，如與NO加合反應而成的熒光產物受pH的影響較小，熒光更加穩定不易淬滅，對NO的檢測靈敏度更高等[11]。DAF-FM本身具有很弱的熒光，光量子產率僅為0.005左右，與NO反應后因生成熒光素化合物，發強烈綠色熒光，光量子產率可高達0.81，因此可根據DAF-FM熒光強度的變化來判斷NO的相對含量。

納米金顆粒即尺寸在1～100 nm范圍內的金微小顆粒，其制備方法簡單，粒徑均勻，且化學性質穩定，主要采用物理法和化學法制備[12]。物理法制備納米金顆粒主要是通過分散技術將塊體金轉變為納米粒子，主要包括真空沉積法、激光消融法等。而化學法是以金的化合物為原料，利用還原反應生成金納米粒子，通過調整反應條件控制顆粒尺寸。基于納米金顆粒的等離子特性、量子尺寸效應等廣泛應用于光催化、光電子學及表面增強光譜等領域[13]，本文采用納米金顆粒與DAF-FM復合，利用金顆粒的光學增益特性有效提高了NO的檢測靈敏度，且該熒光探針可重復使用24次以上，彌補了DAF-FM的單次使用缺陷，實現了NO的可持續重復檢測。

1 納米金顆粒的制備與表征

實驗中所用納米金顆粒是采用激光消融法制得。清洗后的金塊固定于燒杯中，加入2 mL的去離子水。納秒激光通過焦距為50 mm的凸透鏡后聚焦到金塊表面，金塊經激光燒蝕變納米金顆粒。通過透射電鏡(TEM)觀察金顆粒及其分布，如圖1所示，實驗所得金顆粒直徑基本小于4 nm，且一半以上直徑為1～3 nm。

圖1 納米金顆粒TEM圖與尺寸統計分布圖Fig. 1 TEM image of gold nanoparticles and the statistical chart of particle size

2 實驗結果與討論

為了研究納米金顆粒在NO檢測中的作用，分別采用DAF-FM和DAF-FM/納米金顆粒復合材料對與質量分數為1 000 ppm(1 ppm=10-6)的NO進行反應，并采用405 nm激光激發，監測DAF-FM-NO熒光強度隨著納米金顆粒的加入以及反應時間增加而發生的變化。圖2(a)中的譜線1為DAF-FM表面剛接觸NO時的熒光光譜，光譜2為60 s后的熒光光譜，熒光強度基本穩定且維持在300左右。當檢測液中DAF-FM與納米金顆粒比例為1 ∶ 1時，與質量分數為1 000 ppm的NO進行反應，其熒光光譜如圖2(a)中的譜線3和4，其中譜線3為剛通入NO時的熒光光譜，譜線4為NO通入60 s后的熒光光譜。由圖可見金顆粒的加入有效地提高了DAF-FMNO的熒光強度，同時，通入NO后的熒光強度有明顯的變化，60 s時熒光強度可增大82%。由此可見，納米金顆粒能夠有效放大熒光信號并提升DAF-FM的響應速度及靈敏度。

圖2 不同比例的DAF-FM與納米金顆粒的混合液體對不同質量分數的NO的熒光強度變化Fig. 2 Fluorescence intensity variation of mixed liquids with different ratios between DAF-FM and gold

通過調整DAF-FM與納米金顆粒之間的比例可進一步提高檢測靈敏度。不同比例DAF-FM/納米金顆粒復合材料對對質量分數為2 ppm、10 ppm及1 000 ppm的NO反應曲線如圖2(b)～(d)所示。由圖2(b)可知，反應最初5 s內熒光強度迅速增大，尤其當DAF-FM與納米金顆粒比例為2 ∶ 1時，其熒光強度的增幅最為突出可達12%，增幅遠遠大于不含金顆粒的DAF-FM。不同比例DAF-FM/納米金顆粒復合材料對對10 ppm NO的響應見圖2(c)，由圖可見變化趨勢與圖2(b)中基本一致，在DAF-FM與金顆粒比例為2 ∶ 1時，熒光強度增強最為顯著。同樣地，圖2(d)為DAF-FM/納米金顆粒復合材料對對1 000 ppm NO的響應，通過觀察折線變化可知，此時DAF-FM與納米金顆粒最佳配比為1 ∶ 2。由此可見，對于不同質量分數的NO氣體檢測，DAFFM中金顆粒最佳添加量有所不同，這主要是由熒光增強和熒光淬滅雙重效應所導致的。當熒光分子處于金屬納米顆粒附近時，由于金屬納米顆粒表面等離子體局域場增強效應會提高熒光分子的激發效率，產生熒光增強，同時，與金顆粒之間的非輻射能量轉移導致熒光分子的量子產率降低，發生熒光淬滅效應。在DAF-FM/納米金顆粒檢測NO的過程中，這兩種效應并存，適量的金顆?？梢猿浞址糯驞AF-FM-NO的熒光強度，對于熒光的增強高于淬滅，但當金顆粒含量過高時，淬滅效應變得更顯著，一定程度上減弱了熒光增強。當NO的質量分數較高時，DAFFM-NO熒光團數量多，產生較強的熒光，此時多數熒光團信號得到同時放大才會有較明顯的熒光強度提升，因此需要較多的金顆粒。而當NO的質量分數較低時，DAF-FM-NO熒光團數量少，產生熒光較弱，少量熒光團信號得到放大就能顯著改變總熒光強度，因此，少量的金顆粒便可達到最佳效果，金顆粒過量則會導致淬滅加劇。因此在利用金屬納米離子提高DAF-FM檢測靈敏度及相應速度時，應結合實際需求調整納米金粒子的添加量。

為了進一步探究添加納米金顆粒的DAFFM熒光探針在NO檢測中的使用壽命，我們采用比例為1 ∶ 1的DAF-FM/納米金顆粒復合材料對對質量分數為1 000 ppm的NO進行多次重復檢測，每次取5 s時刻的熒光增強幅度，其熒光變化如圖3所示，在15次使用之前，熒光增強幅度維持在20%左右，而在15次之后，其熒光增幅在7%左右，到第24次已經無熒光增強。在實際應用中，動物細胞內的NO質量分數遠小于1 000 ppm，由此可推斷，添加納米金顆粒后的DAF-FM檢測試劑可重復使用24次以上。

圖3 DAF-FM與納米金顆粒比例為1∶1的檢測液對質量分數為1000 ppm的NO反應隨檢測次數的熒光強度的變化Fig. 3 Change in fluorescence intensity with detection times when the liquids with DAF-FM and gold nanoparticles in a ratio of 1∶1 reacted with NO at a concentration of 1000 ppm

3 結論與展望

本文提出了一種基于DAF-FM/納米金顆粒復合材料對的NO檢測方法，顯著提高了NO檢測的靈敏度，且可多次使用。該方法可以拓展到其他氣體的檢測中，可為醫學診斷、環境監測等提供參考。