植物源性食品中抗生素殘留分析方法研究進展

周 杰 安 姣 董 超 趙 靜 張耀海 焦必寧

(西南大學柑桔研究所，重慶 400712)

抗生素是微生物或高等動植物代謝產生的具有抗病原體或其他活性的次級代謝產物，廣泛用于動物疾病防治或作為飼料添加劑用于促進動物生長，因此其在動物源性食品中的殘留問題普遍受到關注，相應的研究也較多[1-3]。而抗生素作為農藥用于防治植物病蟲害會殘留在農產品上，環境中的抗生素通過作物吸收也會進入食品中，植物源性食品中抗生素殘留同樣會對人體健康構成威脅。但目前對該問題關注度較低，相應的研究和綜述也較少。本文介紹了中國抗生素農藥的基本情況，重點對其前處理和檢測技術進行較詳細的綜述。

1 中國抗生素農藥登記及其限量標準

抗生素農藥是指具有農藥功能、用于防治病蟲草鼠等有害生物的天然代謝產物，屬生物農藥范疇。中國登記的抗生素農藥的有效成分有21種，大多為鏈霉菌所產生的代謝產物，農藥產品有2 200多個，約占生物農藥總數的70%[4]。目前，僅阿維菌素、多殺菌素、春雷霉素、多抗霉素、寧南霉素、井岡霉素、伊維菌素和滅瘟素8種有效成分在食品安全國家標準[5]中有限量要求，且多為臨時限量，有限量要求的作物種類也較少，如后兩者分別僅對結球甘藍(0.02 mg/kg)和糙米(0.1 mg/kg)有限量要求。

2 植物源性食品中抗生素來源及在作物中的累積

施用抗生素農藥會直接殘留在植物上，是植物源性食品中抗生素的主要來源。土壤、水體等環境介質也是植物源性食品抗生素的重要來源?？股刂饕ㄟ^人類和動物尿液和糞便進入環境，最終通過淋溶或地表徑流污染土壤、地表水和地下水[6]。同時，醫用抗生素可通過廢水排出或農業灌溉而進入環境。此外，噴施抗生素農藥也會不可避免地殘留于土壤和水體中。這些抗生素通過以上各種途徑進入環境中，進而被植物組織不同程度吸收，通過食物鏈進入人體，對人體健康構成潛在的危害。

已有多篇報道涉及抗生素在植物中的累積[7-8]、遷移和轉運機制[9]、對植物生長[10-11]以及人體膳食風險評估的影響[9,12]。Kang等[13]研究了有機肥中5種抗生素在11種蔬菜中的累積情況，發現絕大多數蔬菜都可吸收有機肥中抗生素，但濃度一般都小于定量限(10 μg/kg)，不會對人體造成健康風險。Ahmed等[14]研究了四環素類(TCs)和磺胺類(SAs)(5，10，20 mg/kg)對黃瓜、番茄和生菜生長的影響及其在作物中的分布及累積情況。結果顯示：SAs和TCs對3種蔬菜生長均具有負面作用，并與濃度呈正相關?？股貙χ参锏亩拘孕煌c其在土壤中吸附，降解及與金屬螯合等作用有關，SAs在土壤中具有較高的遷移性，易被植物吸收，毒性效應強于TCs。此外，抗生素在不同植物和組織中的累積程度不同。對于TCs而言，其在作物中的累積量為番茄(1.021～5.104 mg/kg)>黃瓜(0.574～3.418 mg/kg)>生菜(0.459～1.892 mg/kg)，在葉和根中高于果實。土霉素和金霉素在同一部位的積累量普遍高于四環素。對于SAs而言，其在作物中的累積量為番茄(32.879～101.799 mg/kg)>生菜(18.169～64.458 mg/kg)>黃瓜(15.916～40.341 mg/kg)，積累趨勢與TCs相似，但積累水平遠高于TCs。由于試驗條件下抗生素濃度較高，導致了其在植物中的累積水平也較高，但在實際樣品檢測中，抗生素濃度較低，一般在10-9的水平，如喹諾酮類(QNs)和SAs在蔬菜(干重)中的濃度分別為10.56～193.25 μg/kg[15]和<32.7 μg/kg[16]。

3 樣品前處理方法

3.1 提取方法

植物源性食品中抗生素的提取主要采用溶劑提取法。多數抗生素的結構中包含極性較強的官能團，因此常采用極性溶劑(如乙腈[17]、水[18]、丙酮[19]、甲醇[20]等)作為提取劑，也有用磷酸緩沖液(PBS)[21]的。因樣品常含有色素、纖維素和碳水化合物等物質，基質較為復雜，抗生素可通過氫鍵、疏水作用力及色散力等與之吸附或絡合，導致單一溶劑的提取效果較差，尤其是多抗生素殘留的同時檢測。因此，目前大多選用乙腈、甲醇、丙酮和水的混合溶劑提取[20,22-24]。Chuang等[25]研究發現乙腈、甲醇和水的比例為46∶25∶29時，蔬菜中7種抗生素回收率在70%以上。此外，一些抗生素含堿性或酸性基團，在不同pH溶液中可呈現出不同的離子形態，因此在提取劑中常加入酸(如鹽酸[15]、1%甲酸[26]、0.1%～4%乙酸[16,27]、1%檸檬酸[28])或鹽(Mcllvaine緩沖液)。四環素類抗生素可與金屬離子螯合，還需在提取劑中添加EDTA等絡合劑[29]。

溶劑提取常輔以超聲、振蕩等方式。超聲提取具有效率高、用時短、設備易得的優點，但會導致部分抗生素發生降解，因此也常用振蕩提取代替。李學德等[30]在測定蔬菜中3種SAs殘留時，發現振蕩提取的回收率(83.6%～88.0%)比超聲提取的(77.9%～85.2%)略高。此外，這2種方式也常結合使用[15-16,31]。加壓溶劑萃取法(PLE)具有溶劑用量少、提取充分、操作快速、可重復性高等優點，也常被用于植物中抗生素的提取。Azanu等[32]以水為提取劑，70 ℃加壓萃取10 min，經SPE凈化，測得胡蘿卜和生菜中四環素和阿莫西林的回收率可達86.1%以上。

3.2 凈化方法

目前，植物源性食品中的抗生素殘留檢測常用的凈化方法有液—液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、QuEChERS、分散液液微萃取(DLLME)以及基質固相分散(MSPD)等。

LLE是食品中抗生素傳統的凈化方法，植物源性食品中的抗生素最常用的萃取溶劑是正己烷和二氯甲烷。Liu等[33]采用丙酮/水(體積比1∶1)提取，再以正己烷液—液萃取，利用UPLC-FLD測定了蔬菜中阿維菌素和伊維菌素，其回收率分別為80.3%～110.2%和82.4%～103.4%。但由于該方法操作繁瑣費時，并需大量有機溶劑，目前已結合SPE使用或被其取代。

與LLE相比，SPE可同時完成樣品富集和凈化，回收率和靈敏度高，是食品中抗生素殘留檢測最常用的凈化手段。常用的SPE小柱有HLB柱、C18柱、SCX柱和Florisil柱等，其中，HLB柱的填料為N-乙烯基吡咯烷酮(親水性)-二乙烯基苯(親脂性)，具有兩親平衡性，對多數抗生素具有良好凈化的效果，應用最為廣泛。Wang等[34]建立了同時檢測果蔬中春雷霉素和井岡霉素A的HPLC-TOF-MS/MS方法：樣品經乙腈/水(體積比70∶30，pH 5.5)提取，再經HLB與SCX串聯小柱凈化，目標物回收率較好(81.7%～108%)。Aldeek等建立了柑桔[35]和橙汁[21]中的青霉素G及其代謝物殘留檢測方法：樣品經PBS提取，HLB柱凈化，UPLC-MS/MS檢測，回收率為82%～120%。此外，一些納米材料因其獨特的理化性質也被用作SPE填料。石墨烯是一種二維平面的碳納米材料，比表面積較大，分子易在其表面被吸附和洗脫。采用石墨烯凈化蔬菜中SAs，其效果較C18硅膠和多壁碳納米管好[31]。

QuEChERS法是一種集提取與凈化于一體的方法，其常用的凈化劑是乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基甲硅烷基(C18)和石墨化炭(GCB)。Yu等[36]利用QuEChERS-UPLC-MS/MS法同時檢測了葉菜中20種抗生素殘留，平均回收率為57%～91%。Hu等[24]也建立了同時檢測葉菜類蔬菜中26種殺菌劑抗生素殘留的QuEChERS-HPLC-MS/MS法，結果表明大部分抗生素的回收率為60.0%～98.0%。盡管QuEChERS法的凈化效果不如SPE，并且一些凈化劑如GCB的使用會降低部分抗生素的回收率，但因其操作簡便，無需特殊儀器設備，有機溶劑用量較少，環境友好等，仍成為目前處理大批量樣品中抗生素多殘留檢測常用方法。

DLLME是一種能夠實現快速萃取富集的微型化LLE，具有操作簡單、有機溶劑用量少、富集倍數高等優點。Pirsaheb等[37]利用懸浮固化—分散液液微萃取(DLLME-SFO)檢測了蘋果中的阿維菌素，二嗪農和毒死蜱殘留：以乙腈為分散劑，1-十一烷醇為萃取劑，HPLC-UV檢測，回收率為68%～82%。由于所用的萃取劑多為含氯有機化合物(如氯仿和二氯甲烷)，毒性較大，揮發性強，易對操作人員和環境造成較大毒害[38]，而且DLLME除雜能力較弱，難以應對復雜基質的植物源性食品，故應用較少。

MSPD是在SPE基礎上發展而來的集樣品勻漿、提取、凈化和富集于一體的方法，具有省時省力、快速高效的特點。Zhang等[39]將大米樣品與堿性氧化鋁1∶2混合研磨，再轉入MSPD柱中洗脫，同時用微波輔助萃取，得到阿維菌素回收率為88.6%～91.0%。微波可使樣品溫度升高，從而加快MSPD進程，并提高目標物的回收率，因此，該方法用于大米中阿維菌素的檢測具有顯著的優越性。

表1列出了近年來有關植物源性食品中抗生素的前處理和檢測的方法。

3.3 植物源性食品基質效應

植物源性食品基質效應(Matrix effects，ME)與前處理方法、食品種類、部位及抗生素種類和性質等因素有關。不同凈化方式對果蔬中抗生素基質效應不同。用HLB柱凈化后，果蔬基質對春雷霉素和井岡霉素A的抑制效應較強(ME為-80.4%～-34.2%)，用SCX柱凈化后，基質效應明顯降低(ME為-31.4%～5.23%)，而用HLB柱串接SCX柱后，基質效應可忽略(ME為-11.2%～6.11%)[34]。同一種或同一類抗生素在不同基質中的基質效應表現不同。在葉菜、根菜和果菜類基質中，TCs有增強也有抑制效應，但基質干擾程度較低；SAs總體表現為抑制效應且在白蘿卜上表現強烈(ME為-72.3%～-51.6%)；大環內酯類、截短側耳素類抗生素在大部分基質中表現為抑制效應，而林可酰胺類抗生素卻表現為較低的增強效應；氟喹諾酮類抗生素除恩諾沙星和二氟沙星無明顯基質效應外，其他均表現出強烈的增強或抑制效應(ME為50.9%～75.5%和-75.3%～-50.5%)[33]。同一種基質對于不同抗生素表現出不同的基質效應，葉菜類蔬菜對氟喹諾酮類抗生素的基質效應較小(ME為-20%～29%)，對SAs有中等程度的抑制作用(ME為-60%～-14%)，而對TCs中的四環素基本無基質效應(ME為-7%)，但對土霉素和金霉素卻有強烈的增強效應(ME分別為74%和63%)[40]。此外，作物不同部位的基質效應也稍有差異。水稻不同部位對井岡霉素A的抑制程度有所差別，為稻殼(ME為-82.0%)>糙米(-74.6%)>稻草(-72.4%)[50]。目前很多研究[21,26,36]評估了樣品分析過程中基質效應的大小，但在其影響因素、作用機理等方面還需深入研究。

4 色譜方法

目前關于食品中抗生素檢測以色譜法為主，而液相色譜更是植物源性食品中抗生檢測的主流方法，食品安全國家標準也采用液相色譜法測定植物源性食品中阿維菌素[51-52]和井岡霉素[53]。此外，還有少量用酶聯免疫法(ELISA)的報道[16,54]。

表1植物源性食品中抗生素的檢測方法
Table 1 Detection of antibiotics in plant-derived foods

續表1

4.1 高效液相色譜

測定植物源性食品中抗生素殘留所用色譜柱主要是C18柱，少數用C8柱[19]。流動相多為乙腈—水[35]、甲醇—水[37]，少數為乙腈—甲醇—水[22]。為改善峰型和提高分離度，常在水相中加入乙酸銨[49]、甲酸[36]、乙酸[43]等，添加量一般為0.05%～0.50%。檢測器主要是紫外吸收檢測器(UV)、熒光檢測器(FLD)，少數是光電二級管陣列檢測器(DAD)[55]。利用HPLC-UV檢測蘋果[34]、柑桔[42]、龍眼[56]中阿維菌素的LOD分別為0.7，30.0，5.0 μg/kg；檢測蔬菜中SAs的LOD為6.3～21.1 ng/L[32]。FLD的靈敏度比UV高，但被測物需有強的熒光反應，若被測物沒有產熒光基團，則需進行衍生化作用，操作步驟較繁瑣。利用HPLC-FLD檢測果蔬中阿維菌素類LOD為0.1～10.0 μg/kg[17,23]，SAs的LOD為1～5 μg/kg[16]；檢測黃瓜、大白菜中鏈霉素的LOD為10 μg/kg[47]。

4.2 液相色譜—質譜聯用

液相色譜—質譜聯用結合了色譜的高分離性和質譜的高鑒別能力的優點，是植物源性食品中抗生素殘留檢測的主要方法。因串聯質譜(MS/MS)的靈敏度和選擇性要顯著高于單級質譜(MS)，目前普遍采用高效液相色譜串聯質譜儀(HPLC-MS/MS)，其中以三重四極桿質譜(QQQ)和四極桿線性離子阱質譜(Q-Trap)應用最為廣泛[21,24,49]。采用HPLC-MS/MS(QQQ)測定，植物源性食品中阿維菌素、春雷霉素、SAs、QNs等抗生素的LOD在0.09～30.00 μg/kg(或μg/L)[13,40,43,57]，其中泰妙菌素的LOD可達0.005 μg/kg[24]。以HPLC-MS/MS(Q-Trap)檢測植物源性食品中的多殺菌素、多抗霉素D、青霉素G及其兩種代謝物等抗生素的LOD分別為2～29[44]，50[26]，0.1[21]μg/kg。與QQQ和Q-Trap相比，四極桿飛行時間質譜(Q-TOF)分辨率較高(>10 000)，質量范圍較寬(上限約15 000道爾頓)，因此在高相對分子質量分析中具有重要作用，但其線性范圍較窄、靈敏度較低且成本較高，在常規實驗室或日常定量檢測中使用相對有限?？紤]到Q-TOF的高選擇性，相信未來其將逐漸成為食品中抗生素殘留測定的重要工具。

5 展望

目前已有少許果蔬、糧谷等農產品中抗生素殘留檢測方法的報道[29,31,36]，但主要是儀器檢測法，方法較為單一。由于植物源性食品的保鮮及儲藏問題，開發如膠體金試紙條等現場快檢方法和Q-TOF等實驗室快速篩查方法將是今后植物源性食品抗生素殘留檢測研究的一個重點方向。同時，目前關于植物中抗生素的分析方法多關注于某一種或一類抗生素的檢測，方法的適用面較窄，并且對代謝產物的檢測分析研究較少。因此為全面準確地評估人類通過膳食的暴露風險，需要加強對多類型抗生素同時檢測和對其代謝物的檢測研究。另外，在基質效應的主要影響因素、形成機理等方面還需要進一步研究。這些問題的研究和解決，有助于進一步建立高效快捷、靈敏穩定、自動化程度更高的抗生素多殘留檢測技術。