醬油釀造風(fēng)味細(xì)菌研究進(jìn)展

許延濤 周 凱 蔣雪薇，2,2 梁勝男 張 偉 彭 東 周尚庭 羅曉明

(1.長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；2.湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410600；3.加加食品集團(tuán)股份有限公司，湖南 長沙 410600)

醬油是起源于中國的重要餐桌調(diào)味品，自有記載起距今已有2 000多年歷史[1]1-5，因味道鮮美、富含營養(yǎng)而深受消費(fèi)者喜愛。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，消費(fèi)者的消費(fèi)能力及消費(fèi)品味逐漸提高，促進(jìn)了醬油市場(chǎng)由過去的中低端產(chǎn)品主導(dǎo)轉(zhuǎn)向高端產(chǎn)品主導(dǎo)。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，2017年1～12月中國高端醬油的銷量額總體呈上升趨勢(shì)，其中50元以上高端醬油銷售額在2017年12月占據(jù)總銷售額的40%～45%，而其全年銷售額占比達(dá)約25%。高端醬油對(duì)于原料及生產(chǎn)技術(shù)提出了更高的要求，原來普遍采用的低鹽固態(tài)發(fā)酵及自然曬露發(fā)酵已無法滿足產(chǎn)品安全及風(fēng)味提升的要求，為此，中國大型醬油生產(chǎn)企業(yè)在借鑒日式高鹽稀態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展了以連續(xù)蒸料炒麥、圓盤制曲、罐式發(fā)酵、連續(xù)布醬壓榨、膜過濾等工藝為特征的現(xiàn)代高鹽稀態(tài)工藝。該工藝在16%～18%的高鹽體系下發(fā)酵4～6個(gè)月，連續(xù)封閉的系統(tǒng)有效地減少了污染微生物的生長及代謝，但也阻礙了對(duì)醬油品質(zhì)及風(fēng)味有貢獻(xiàn)的微生物在醬醪發(fā)酵中的生長，影響了釀造醬油風(fēng)味物質(zhì)的豐富度，進(jìn)而導(dǎo)致成品醬油醇厚感不足、風(fēng)味單薄。解決上述問題的關(guān)鍵是風(fēng)味菌在發(fā)酵過程中添加各種功能性風(fēng)味菌，構(gòu)建有利于釀造醬油風(fēng)味發(fā)展且安全的微生物群落結(jié)構(gòu)，促使醬油在多菌種釀造的過程中形成滋味更加醇厚鮮美、風(fēng)味更加濃郁的產(chǎn)品[3]。醬油釀造用風(fēng)味菌主要有酵母和細(xì)菌，對(duì)醬油酵母的研究開展較早，如安琪酵母股份有限公司在醬油酵母領(lǐng)域開展了一些研究及產(chǎn)業(yè)化工作[4]；而對(duì)風(fēng)味細(xì)菌的研究則剛起步。隨著國內(nèi)外對(duì)醬油釀造風(fēng)味細(xì)菌的選育及功能基因組學(xué)[5]、風(fēng)味物質(zhì)分析[6-8]及代謝組學(xué)[9]等領(lǐng)域研究的深入及技術(shù)的發(fā)展，醬油釀造風(fēng)味細(xì)菌將為醬油的風(fēng)味化提升及功能性發(fā)展提供更多的支撐。

1 釀造醬油的風(fēng)味構(gòu)成

釀造醬油的風(fēng)味主要從香氣、滋味2個(gè)方面來描述[10]。風(fēng)味的形成主要依靠有機(jī)酸、醇、酯、醛、酮、酚類物質(zhì)及一些雜環(huán)化合物[11]，這些物質(zhì)在釀造過程中相互作用，構(gòu)成了醬油的主體風(fēng)味。隨著現(xiàn)代分析儀器的發(fā)展，對(duì)醬油香氣成分的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、含量等信息有了更加透徹的了解，目前，醬油已有約300種揮發(fā)性風(fēng)味成分被成功分離并鑒定[12]。Nunamura等[13]通過深入研究后提出可將醬油的風(fēng)味成分分為中性部分、酸性部分及堿性部分3部分，并最終鑒定出270種化合物，酸性部分共包括93種物質(zhì)，其中對(duì)醬油風(fēng)味成分貢獻(xiàn)最大，最具代表性的物質(zhì)為4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)；中性成分中則以4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG)最具代表性。醬油中的風(fēng)味物質(zhì)大多與微生物代謝有關(guān)，其中醛、酮、酚、酯等氣味閾值較低的物質(zhì)與細(xì)菌的代謝有密切關(guān)系[14]；此外，還有一些物質(zhì)的產(chǎn)生則與原料及原料處理(如大豆及豆粕的蒸煮、小麥的焙炒)、醬油熱殺菌等工序有關(guān)[15-16]。

2 醬油釀造風(fēng)味細(xì)菌

醬油風(fēng)味細(xì)菌是指在醬油發(fā)酵過程中的次生細(xì)菌，包括多種耐高鹽乳酸菌，如四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)等，以及芽胞桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)的一些細(xì)菌。乳酸菌是一類能代謝各種糖類物質(zhì)產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的總稱，醬油發(fā)酵中的乳酸菌通常還具有耐高鹽這一普通乳酸菌不具備的性質(zhì)，通過在發(fā)酵環(huán)境中代謝酸類物質(zhì)及分泌抑菌肽[17]，將發(fā)酵體系轉(zhuǎn)變?yōu)槠岬沫h(huán)境，能在一定程度上抑制雜菌的污染，有利于醬油的減鹽發(fā)酵，同時(shí)有利于一些風(fēng)味酵母的生長及代謝[1]153-161；葡萄球菌作為風(fēng)味細(xì)菌在發(fā)酵肉制品中應(yīng)用較多[18-20]，其本身具有很強(qiáng)的耐高鹽能力，容易馴化，近年來也有學(xué)者[21]將其應(yīng)用于魚醬油發(fā)酵中；芽胞桿菌通常具有較高的蛋白酶活性及淀粉酶活性，有利于醬油中蛋白質(zhì)及淀粉的分解[22]。醬油風(fēng)味細(xì)菌的研究起步較晚，在生產(chǎn)中的應(yīng)用程度較淺，此外，尚有許多風(fēng)味細(xì)菌未被應(yīng)用或發(fā)現(xiàn)，這需要在此領(lǐng)域內(nèi)的學(xué)者們進(jìn)行更加深入的研究。

3 風(fēng)味細(xì)菌代謝與醬油風(fēng)味

風(fēng)味細(xì)菌在醬油發(fā)酵過程中分解原料中的蛋白質(zhì)及淀粉形成氨基酸、單糖及寡糖，這些物質(zhì)本身可對(duì)醬油風(fēng)味產(chǎn)生影響，還可進(jìn)一步由細(xì)菌代謝形成各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)而構(gòu)成醬油的香氣，醬油釀造風(fēng)味細(xì)菌及其在醬油發(fā)酵中的作用如表1所示。從表1可以看出，在高鹽的醬油發(fā)酵體系中，能代謝產(chǎn)生醬油風(fēng)味物質(zhì)的細(xì)菌種類不多，但其代謝對(duì)于醬油風(fēng)味的形成具有重要的作用。

表1 風(fēng)味細(xì)菌在醬油發(fā)酵中的作用Table 1 Effect of flavor bacteria in soy sauce fermentation

3.1 風(fēng)味細(xì)菌代謝與醬油滋味

醬油滋味可用鮮甜酸咸來概括。其中咸味主要來源于發(fā)酵中所添加的食鹽，高鹽稀態(tài)工藝中的食鹽含量通常高達(dá)16%～18%；食鹽除了提供醬油咸味之外，還能在發(fā)酵中與一些呈味氨基酸結(jié)合形成氨基酸鹽，故其具有提鮮提甜的作用。醬油中的甜味主要來自于淀粉水解生成的單糖及二糖，如葡萄糖、麥芽糖等，此外還包括一部分氨基酸[11]。

鮮味是醬油品質(zhì)的重要評(píng)判指標(biāo)[28]，醬油鮮味的來源主要是L-谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等呈味氨基酸。米曲霉是醬油釀造的主發(fā)酵菌種，是一種好氧發(fā)酵真菌，具有完整的酶系，能在合適的發(fā)酵環(huán)境中產(chǎn)生含量較高的酸性、中性及堿性蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶等[29]；而谷氨酰胺酶能在發(fā)酵過程中催化L-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸，因此，米曲霉對(duì)發(fā)酵醬油鮮味的產(chǎn)生有著非常重要的作用；不僅如此，米曲霉對(duì)醬油中醇類、醛類、酚類及酯類物質(zhì)的產(chǎn)生也有重要的促進(jìn)作用，這些物質(zhì)很多都對(duì)醬油鮮味及其他風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)[30]。而近年來研究發(fā)現(xiàn)[21,26]，解淀粉芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌及葡萄球菌屬的一些細(xì)菌也具有較強(qiáng)的L-谷氨酰胺酶代謝能力，因此可以認(rèn)為醬油的鮮味的產(chǎn)生不僅依賴于米曲霉，也依賴于醬油發(fā)酵中的次生菌。

醬油中的酸味來源于有機(jī)酸類物質(zhì)，其中的主要有機(jī)酸包括乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲酸等。醬油發(fā)酵過程中形成的有機(jī)酸之間的協(xié)同增效作用對(duì)醬油獨(dú)特滋味的形成具有重要貢獻(xiàn)[31]，一些有機(jī)酸還能降低生物胺的產(chǎn)量消除發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胺臭味[32]。就各種有機(jī)酸單獨(dú)的作用而言，乳酸酸味平緩柔和，能使醬油口感更加細(xì)膩綿長[24]；乙酸具有刺激的酸味，少量乙酸能適度賦予醬油酸味；琥珀酸的一鈉鹽是一種食品增鮮劑，對(duì)醬油具有提鮮作用[33]；但醬油中的酸類物質(zhì)總量不能過多，否則將會(huì)導(dǎo)致醬油過酸[11]。酸類物質(zhì)主要由一些產(chǎn)酸細(xì)菌代謝糖類物質(zhì)產(chǎn)生，這些產(chǎn)酸細(xì)菌主要包括醬油四聯(lián)球菌(Tetragenococcussojae)、嗜鹽片球菌(Pediococcushalophilus)、嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)、醬油片球菌(Pediococcussojae)、植物乳桿菌(LactobacillusPlanterum)、魏斯氏乳酸菌(Weissellaconfusa)等，它們均可被歸為耐鹽乳酸菌[23-24,34]。Singracha等[32]研究發(fā)現(xiàn)將嗜鹽四聯(lián)球菌TS71與魯氏酵母混合添加于醬油發(fā)酵過程中能有效增加酸類、醇類及呋喃酮的含量，異戊酸及苯甲酸增加明顯，這2種物質(zhì)分別具有干酪香氣及玫瑰花香氣；李巧玉等[34]研究發(fā)現(xiàn)某些魏斯氏菌有較強(qiáng)的生物胺降解能力，能降解多種生物胺，因此魏斯氏菌有利于消除醬油釀造中的臭味。植物乳桿菌因其耐鹽性差而較難應(yīng)用于醬油的高鹽稀態(tài)工藝，趙國忠等[24]分離出一株能耐受18%鹽濃度的植物乳桿菌，該植物乳桿菌雖然能在高鹽濃度下生長，但生長情況較差，其代謝受到了嚴(yán)重影響，不適用于高鹽稀態(tài)發(fā)酵。最近幾年的研究還發(fā)現(xiàn)，除了上述耐鹽乳酸菌外，一些葡萄球菌也具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸作用，如胡傳旺等[25]從醬醪中分離出9株風(fēng)味細(xì)菌，其中葡萄球菌JY09的乳酸產(chǎn)量達(dá)到2.06 g/L，與唾液乳酸桿菌(Lactobacillussalivarius)B1相當(dāng)(2.13 g/L)，略高于戊糖乳酸片球菌(Pediococcuspentosaceus)JY08(1.77 g/L)，乙酸產(chǎn)量僅略低于T.halophilusMRS1。

3.2 風(fēng)味細(xì)菌代謝與醬油香氣

香氣是醬油重要的感官屬性，醬油感官評(píng)定中香氣占據(jù)著較高的評(píng)分權(quán)重，醬油香氣物質(zhì)通常是在醬醪發(fā)酵的中后期經(jīng)過風(fēng)味細(xì)菌的代謝生成[10,35]。香氣成分包括了醇類、有機(jī)酸、醛類、酚類及酯類等，香氣物質(zhì)在醬油中含量很低，但其閾值通常也非常低，如4-EG在醬油中含量達(dá)0.5～1.5 mg/kg時(shí)就能明顯提升醬油的香氣[11]，4-EG、HEMF及4-已基苯酚(4-EP)是目前公認(rèn)的影響醬油香氣的主要成分[36]，一般認(rèn)為4-EG的形成跟酵母、芽胞桿菌和一些耐鹽葡萄球菌關(guān)系較大[37-38]，主要是在發(fā)酵過程中酵母細(xì)菌將阿魏酸轉(zhuǎn)化成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(4-VG)后再將4-VG轉(zhuǎn)化成4-EG；此外，有研究[39]表明一些芽胞桿菌有較強(qiáng)的阿魏酸代謝能力，可以認(rèn)為芽胞桿菌對(duì)醬油發(fā)酵中4-EG的生成有正向的影響，Jiang等[27]則研究發(fā)現(xiàn)添加B.subtilis的發(fā)酵醬油4-EG的含量相比對(duì)照組有明顯提高。酯類物質(zhì)形成于發(fā)酵的中后期，主要通過風(fēng)味細(xì)菌代謝讓醇類和酸類物質(zhì)產(chǎn)生酯化反應(yīng)生成；醛類物質(zhì)則是由淀粉被酶解為葡萄糖后，經(jīng)細(xì)菌醛酸途徑生成，醛類物質(zhì)具有辛辣刺激氣味，在醬油中能調(diào)和香氣。醬油中檢出的苯乙醛、異丁醛、異戊醛、1-辛烯-3-醇、2-甲基丁醇、戊醇、異戊醇、2,3-丁二醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯等均能賦予醬油獨(dú)特的香氣，其中乙酸乙酯具有清新的水果香氣，乙酸異戊酯具有類似香蕉的香氣[40]，乳酸乙酯具有酒味香氣[41]，2-甲基丙醇具有麥芽香氣[42]，而苯乙醛有濃郁的玉簪花香氣的同時(shí)還具有風(fēng)信子、水仙等花的芳香[41]。

醬醪中不同的微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)香氣物質(zhì)的形成有較大影響，如Harada等[43]通過研究提出產(chǎn)乳酸細(xì)菌對(duì)糠醛(呋喃甲醛)、糠醇(呋喃甲醇)、甲基環(huán)戊烯醇酮(3-甲基-2羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮)及甲硫基丙醛有較大影響，此外，酯類前體物質(zhì)之一是有機(jī)酸，而產(chǎn)酸細(xì)菌存在與否對(duì)醬油中一些有機(jī)酸的含量有較大影響，也就間接對(duì)這些酯類的含量產(chǎn)生了影響。

4 釀造醬油風(fēng)味細(xì)菌研究技術(shù)進(jìn)展

風(fēng)味細(xì)菌具有多種代謝途徑，并產(chǎn)生多樣的代謝產(chǎn)物，其中許多代謝產(chǎn)物能賦予醬油特殊的風(fēng)味，但也有一些能形成不利的影響甚至安全風(fēng)險(xiǎn)，如生物胺能敗壞醬油風(fēng)味、氨基甲酸乙酯則是被國際腫瘤研究中心認(rèn)定為2A級(jí)致癌物[44]。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)全面系統(tǒng)地研究釀造醬油風(fēng)味細(xì)菌成為其應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。高通量測(cè)序、全基因序列分析、功能基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等現(xiàn)代化技術(shù)因其快速、精準(zhǔn)的特點(diǎn)被應(yīng)用于風(fēng)味細(xì)菌的研究中，對(duì)實(shí)現(xiàn)風(fēng)味細(xì)菌應(yīng)用中的趨利避害起了較好的作用。

4.1 高通量測(cè)序在釀造醬油風(fēng)味細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

測(cè)序技術(shù)由一代測(cè)序[45](Sanger測(cè)序)，到以454焦磷酸測(cè)序法[46]、Illumina測(cè)序法[47]、SOLID測(cè)序法[48]為代表的二代測(cè)序，進(jìn)而發(fā)展到Helicos的SMS技術(shù)和Pacific Bioscience的SMRT技術(shù)為代表的第三代測(cè)序技術(shù)[49]，其讀長和精確度不斷提升。高通量測(cè)序可以快速地獲得環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的信息[50]，目前已從土壤[51]、水體[52]等體系的研究中轉(zhuǎn)移到發(fā)酵食品的研究中，Song等[53]利用高通量測(cè)序分析傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵醬油中的微生物群落，發(fā)現(xiàn)醬油固態(tài)發(fā)酵體系內(nèi)的核心細(xì)菌群落包含11個(gè)細(xì)菌屬，如乳桿菌屬、芽胞桿菌屬、醋桿菌屬、片球菌屬等，而其中乳桿菌屬占據(jù)了最高的相對(duì)豐度；沈馨等[54]對(duì)辣椒醬中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)Bacillus和Staphylococcus是其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌微生物，相對(duì)含量分別為37.62%和20.66%。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，能更加準(zhǔn)確地獲得醬油釀造中風(fēng)味菌，實(shí)現(xiàn)其合理有效應(yīng)用。

4.2 全基因序列分析及功能基因組學(xué)研究解析風(fēng)味細(xì)菌作用機(jī)制

對(duì)風(fēng)味細(xì)菌的全基因序列分析及功能基因組學(xué)研究，可以更直接、更全面地理解其代謝途徑，并可將基因與其相關(guān)代謝物的合成聯(lián)系起來，更確切地解釋各個(gè)基因的作用。Dong等[5]對(duì)葡萄球菌S.condimentDSM1674全基因測(cè)序及對(duì)比分析，在菌種的基因組中注釋到了乳酸脫氫酶基因，該酶能在無氧條件下通過糖酵解途徑中將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸，此外，注釋了28個(gè)與該菌種耐高滲高鹽環(huán)境相關(guān)的基因，由此解釋了菌種的耐鹽特性，說明該菌株能在高鹽的醬油發(fā)酵體系中代謝出乳；李豆南等[55]對(duì)醬香大曲中鏈霉菌菌株FBKL4.005進(jìn)行全基因測(cè)序及序列分析后得到7.33 Mb有效數(shù)據(jù)量及7 946個(gè)注釋基因，并通過GO注釋等方式完成了基因組預(yù)測(cè)魚基本功能注釋。目前結(jié)合全基因序列分析及功能基因組學(xué)研究風(fēng)味細(xì)菌作用機(jī)制的報(bào)道較少，大多是應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中病原微生物基因的分析[56]，隨著釀造醬油風(fēng)味細(xì)菌研究的深入，該技術(shù)將成為準(zhǔn)確解釋風(fēng)味物質(zhì)的形成及有效提升產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力的重要手段。

4.3 代謝組學(xué)對(duì)解析并調(diào)控風(fēng)味細(xì)菌代謝的研究進(jìn)展

代謝組學(xué)(Metabolomics)是通過考察生物體系受刺激或擾動(dòng)后，其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化來研究生物體系的科學(xué)。生物體的代謝十分復(fù)雜迅速，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究很難覆蓋生命體系中一些非常活躍且十分重要的物質(zhì)，而代謝組學(xué)則能彌補(bǔ)這一缺陷[57]。色譜技術(shù)、光譜技術(shù)等是研究代謝組學(xué)的主要技術(shù)，其通過檢測(cè)包括糖、糖醇、有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸以及大量次級(jí)代謝物來獲取代謝通路信息及代謝中間產(chǎn)物變化信息實(shí)現(xiàn)代謝組學(xué)研究[58]。

醬油的研究中，已有一些學(xué)者將代謝組學(xué)運(yùn)用于風(fēng)味細(xì)菌及風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)研究，解析了風(fēng)味細(xì)菌在醬油發(fā)酵過程中的代謝機(jī)制。Zhang等[59]通過添加解淀粉芽胞桿菌JY06代謝了醬油發(fā)酵過程中產(chǎn)生的精氨酸，從而阻斷了瓜氨酸的合成，并大大減少了氨基甲酸乙酯的產(chǎn)生，不僅如此，JY06的添加也增加了發(fā)酵醬油中酯和酮類物質(zhì)的種類；楊怡敏等[60]則利用P.pentosaceus研究了瓜氨酸在醬油發(fā)酵中的積累機(jī)制，發(fā)現(xiàn)高鹽條件是導(dǎo)致瓜氨酸積累的最重要因素；Ghulam等[61]通過對(duì)20多種不同來源及品牌的醬油中微生物的代謝物進(jìn)行分析研究，提出了分辨高品質(zhì)醬油的依據(jù)。

5 總結(jié)

消費(fèi)者對(duì)醬油品質(zhì)的追求促進(jìn)了高品質(zhì)醬油釀造工藝的發(fā)展，醬油釀造風(fēng)味細(xì)菌的研究及其應(yīng)用成為推動(dòng)工藝發(fā)展的重要途徑，也將成為研究的熱點(diǎn)之一。各種風(fēng)味細(xì)菌與主發(fā)酵菌種在長期發(fā)酵中相互作用，代謝產(chǎn)生的各種物質(zhì)相互反應(yīng)，構(gòu)成了醬油復(fù)雜的風(fēng)味物質(zhì)體系，從而形成了醬油特有的風(fēng)味。隨著高通量測(cè)序、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用，深入研究風(fēng)味細(xì)菌、擴(kuò)大其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)、發(fā)掘其在減鹽釀造中的應(yīng)用潛力、實(shí)現(xiàn)多菌種混合發(fā)酵、優(yōu)化醬油風(fēng)味，將為生產(chǎn)安全健康、鮮咸適口、醬香醇厚的優(yōu)質(zhì)醬油提供有力保障。