不同抗阻訓練方案對T淋巴細胞亞群遷移和凋亡的影響*

王焱源

(鄭州航空工業管理學院 體育教學部，河南 鄭州 450015)

規律抗阻訓練能夠刺激肌肉產生生理適應以提高肌肉力量、爆發力、肌肉耐力并促進肌肉肥大，其效果與訓練方案中運動方式、運動負荷、運動順序、間歇時間等因素有關。多項研究針對抗阻訓練對肌肉力量、肌肉功能、身體成分以及相關健康體適能參數的影響進行了深入闡釋，然而抗阻訓練對于免疫細胞遷移和凋亡至今知之甚少。既往的研究主要集中在高強度和/或離心運動(可造成肌肉損傷)對于免疫細胞應答的影響，甚至在訓練方案上與實踐脫節[1, 2]。Pereira等[3]強調，探討免疫系統對于急性運動反應與適應有助于設計科學合理的運動處方。

研究發現[4]，運動能夠誘導外周血淋巴細胞計數出現雙相變化。運動開始時淋巴細胞快速動員入血，造成外周血淋巴細胞計數顯著升高，運動后30 min～2 h外周血淋巴細胞計數低于安靜水平(淋巴細胞減少癥)，6～24 h恢復。淋巴細胞減少部分原因與其凋亡(程序性細胞死亡)和/或遷移(淋巴細胞從循環池進入組織淋巴細胞池)有關[5, 6]。Annexin V(鈣磷脂結合蛋白Ⅴ)是胞內蛋白annexin家族的一員，能夠與磷脂酰絲氨酸結合，因此可作為識別凋亡細胞的表面標志物[7]。此外，淋巴細胞可在循環池和淋巴細胞池之間自由遷移以維持免疫系統穩態。由于趨化因子CX3C受體1(CX3CR1)與其配體(CX3CL1)結合后介導淋巴細胞黏附與遷移，因此可通過CX3CR1表達而特異性甄別淋巴細胞遷移[8]。Pereira等[3]近期的一項研究顯示，CD4+和CD8+T淋巴細胞在一次急性抗阻訓練后24 h發生明顯的遷移和凋亡，有趣的是，這一效應并不受抗阻訓練過程中組間間歇時間的影響。Asano等[9]針對未經訓練者設計了三種抗阻訓練方案分別用于促進肌肉肥大、改善肌肉耐力和提高最大肌力，結果發現，其他兩種方案比較，促進肌肉肥大方案訓練后血清肌酸激酶(肌肉損傷標志物)和乳酸濃度顯著升高，而血糖則明顯下降。然而不同方案急性抗阻訓練對CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群遷移和凋亡的影響鮮有關注。因此，本研究針對未經訓練的青年，設計兩種不同方案的抗阻訓練，分別以促進肌肉肥大和以改善肌肉耐力為目的，觀察訓練前后CD4+和CD8+T淋巴細胞遷移和凋亡的變化并探討其可能機制。我們推測，與改善肌肉耐力方案比較，促進肌肉肥大抗阻訓練方案能夠誘導T淋巴細胞遷移和凋亡標志物表達量明顯上調。

1 研究對象和方法

1.1 受試對象

15名青年男性自愿參加本實驗，其一般情況如表1所示。受試者身體健康、無免疫系統、心血管系統以及骨骼肌肉系統疾病，排除半年內使用藥物、營養保健品者以及長期煙酒、咖啡嗜好者。通過問卷調查以及美國運動醫學會分類標準[10]，受試者無抗阻訓練經歷。實驗前告知其實驗目的、實驗流程、運動風險，簽訂知情同意書。

表1 受試者一般變量特征

1.2 整體實驗設計

所有受試者共完成5次測試和4次取血，整體實驗設計見圖1所示。第1～2次：受試者了解實驗流程，熟悉實驗設備和抗阻訓練器械的使用并進行人體測量學參數檢測(包括年齡、身高、體重、體脂百分比、心率和血壓，見表1)。第3次：72 h后進行1RM(最大重復次數，maximal repetitions)測試；第4～5次：1周后分別進行一次以促進肌肉肥大為目的的抗阻訓練方案(resistance training protocol for muscle hypertrophy，H-RT組)和一次以改善肌肉耐力為目的的抗阻訓練方案(resistance training protocol for muscle endurance，E-RT組)，訓練強度分別為70%1RM和60%1RM，兩次訓練之間間隔1周，受試者測試順序采用隨機原則。分別于訓練前(Pre)，訓練后即刻(Post)、訓練后2 h(Post-2h)和訓練后24 h(Post-24h)取靜脈血2 mL利用流式細胞儀通過測定表面標志物annexin V和CX3CR1表達量檢測CD4+和CD8+T淋巴細胞遷移和凋亡。囑受試者實驗前2天保證充足睡眠并避免劇烈運動，實驗前與實驗過程中禁止吸煙，飲酒以及服用任何藥物或營養補劑。

圖1 整體實驗設計

1.3 熟悉抗阻訓練器械以及運動測試

受試者熟悉抗阻訓練器械時，針對主要大肌肉群完成3組、每組10～12RM訓練。72 h后進行1RM測試，即通過增減配重，受試者只能重復1次所對應的重量(kg)，重復三次，取最高值。為減少測量誤差，依照Inoue等[11]的建議采取以下措施：(1)測試前充分熟悉器械的使用；(2)保證每次測試的程序和條件基本一致；(3)同一動作(肌肉群)三次測試間間隔5 min，下一動作開始測試前休息10 min；(4)上下肢肌肉測試輪流進行(即按照“上肢肌→下肢肌→上肢肌→下肢肌”順序)；(5)測試時間在一天中的同一時間段進行，以避免生物節律的影響。

1.4 訓練方案

受試者先進行10 min準備活動，包括5 min拉伸和5 min慢跑，然后根據ACSM推薦的方案[10]分別進行一次H-RT或E-RT，訓練強度分別為70%1RM和60%1RM，兩次訓練之間間隔1周。每次訓練包含8個動作，順序如下：胸部臥推(胸大肌)、坐姿下拉(背闊肌)、坐姿腿屈伸(股四頭肌)、直立劃船(三角肌和斜方肌)、俯臥腿彎舉(股二頭肌)、三頭肌下拉(肱三頭肌)、站姿提踵(小腿三頭肌)和啞鈴彎舉(肱二頭肌)，共完成3組。H-RT每組完成10次(10RM)，相鄰動作之間間歇1 min，組間間歇1.5 min；E-RT組每組完成15次(15RM)，相鄰動作之間以及組間間歇均為1 min；總時間約50～60 min。

1.5 外周血T淋巴細胞亞群計數以及細胞遷移與凋亡測定

分別于不同強度抗阻訓練前(Pre)，訓練后即刻(Post)、訓練后2 h(Post-2h)和訓練后24 h(Post-24h)肘正中靜脈取血2 mL，肝素抗凝，利用流式細胞儀(FACS 420型，美國BD公司)檢測CD4+和CD8+T淋巴細胞計數以及遷移和凋亡。

取100 μL抗凝血，按照試劑盒說明與CD4-APCeFluor780和CD8-V500單克隆熒光抗體(購自武漢博士德生物工程有限公司)避光孵育30 min。加入2 mL紅細胞裂解液，避光孵育20 min，300 g離心5 min。PBS緩沖液2 mL洗滌，離心5 min。流式細胞儀上機檢測淋巴細胞亞群免疫表型分型以及CD4+和CD8+T淋巴細胞計數。

取200 μL全血與250 μL抗體混勻后在暗室中孵育30 min，300 g離心5～10 min，棄上清后加入2 mL紅細胞裂解緩沖液裂解10 min，加入磷酸緩沖鹽溶液后離心，上機檢測。分別使用CX3CR1和annexin V單克隆抗體(購自武漢博士德生物工程有限公司)進行CD4+和CD8+T淋巴細胞遷移和凋亡測定(用陽性表達率表示)。

1.6 統計方法

使用SPSS 19.0統計軟件包對數據進行統計分析，所有數據以“均數±標準差”表示。淋巴細胞遷移、凋亡分別用CX3CR1和annexin V的陽性表達率表示，抗阻訓練后淋巴細胞計數、凋亡與遷移的變化以與訓練前差值的變化率(△%)表示，即△%=(訓練后值-訓練前值)/訓練前值×100%。組間(H-RTvs. E-RT)完成的總重復次數和總訓練負荷比較使用獨立樣本t檢驗。組內(H-RT或E-RT)不同時間點(Post、Post-2h和Post-24 h)與訓練前(Pre)比較以及同一時間點組間(H-RTvs. E-RT)使用卡方檢驗；組內比較時，當annexin V和CX3CR1陽性表達率與細胞計數變化率具有顯著性差異時說明淋巴細胞凋亡和遷移的變化具有統計學意義[3, 12]。統計學差異定為P<0.05。

2 結果

2.1 不同強度抗阻訓練時完成的總重復次數和總訓練負荷比較

表2為不同強度抗阻訓練時完成的總重復次數和總訓練負荷(總次數×重量)，其中E-RT組總重復次數和總訓練負荷均顯著性高于H-RT組(P<0.05)。

表2 不同強度抗阻訓練時完成的總重復次數和總訓練負荷比較

注：與高強度比較，*P<0.05

2.2 兩組CD4+T和CD8+T細胞計數以及annexin V和CX3CR1陽性表達率的變化

H-RT組：運動后各時間點，CD4+T細胞計數無顯著性變化(P>0.05)；運動后即刻以及24 h，CD4+T細胞annexin V和CX3CR1陽性表達率顯著性升高(P<0.05)，運動后2 h則無顯著性差異(P>0.05)。運動后各時間點，CD8+T細胞計數無顯著性變化(P>0.05)；運動后即刻、2 h以及24 h，CD8+T細胞annexin V和CX3CR1陽性表達率均顯著性升高(P<0.05)。見圖2～3。

E-RT組：運動后各時間點，CD4+T細胞計數無顯著性變化(P>0.05)；CD4+T細胞annexin V陽性表達率在運動后即刻降低(P<0.05)，24 h顯著性升高(P<0.05)；CD4+T細胞CX3CR1陽性表達率僅在運動后即刻升高(P<0.05)；運動后2 h均無顯著性差異(P>0.05)。運動后，CD8+T細胞計數顯著性升高(P<0.05)；CD8+T細胞annexin V陽性表達率在運動后即刻、2 h和24 h均顯著性升高(P<0.05)；CD8+T細胞CX3CR1陽性表達率僅在運動后即刻和24 h升高(P<0.05)，運動后2 h則無顯著性差異(P>0.05)。見圖4～5。

組間比較，H-RT組CD4+T細胞annexin V陽性表達率在運動后即刻和24 h高于E-RT組(P<0.05)，CX3CR1陽性表達率在運動后即刻低于而運動后24 h高于E-RT組(P<0.05)；H-RT組CD8+T細胞annexin V陽性表達率在運動后2 h低于而24 h高于E-RT組(P<0.05)，CX3CR1陽性表達率在運動后2 h高于E-RT組(P<0.05)。見圖6～9。

圖2 H-RT組CD4+T細胞計數，annexin V和CX3CR1陽性表達率的變化注：與細胞計數比較，*P<0.05

圖3 H-RT組CD8+T細胞計數，annexin V和CX3CR1陽性表達率的變化注：與細胞計數比較，*P<0.05

圖4 E-RT組CD4+T細胞計數，annexin V和CX3CR1陽性表達率的變化注：與細胞計數比較，*P<0.05

圖5 E-RT組CD8+T細胞計數，annexin V和CX3CR1陽性表達率的變化注：與細胞計數比較，*P<0.05

圖6 H-RT和E-RT組CD4+T細胞annexin V陽性表達率比較注：與E-RT比較，*P<0.05

圖7 H-RT和E-RT組CD4+T細胞CX3CR1陽性表達率比較注：與E-RT比較，*P<0.05

圖8 H-RT和E-RT組CD8+T細胞annexin V陽性表達率比較注：與E-RT比較，*P<0.05

圖9 H-RT和E-RT組CD8+T細胞CX3CR1陽性表達率比較注：與E-RT比較，*P<0.05

3 討論

本研究設計旨在促進肌肉肥大(70%1RM，H-RT組)以及增強肌肉耐力(60%1RM，E-RT組)的兩種抗阻訓練方案，其目的在于對比不同方案抗阻訓練誘導外周血T淋巴細胞免疫反應的差異。我們假設，H-RT組誘導的T淋巴細胞遷移和凋亡理應顯著高于E-RT組。本研究發現：(1)抗阻訓練后即刻，E-RT組CD4+T淋巴細胞遷移增加、凋亡下降，而H-RT組遷移和凋亡均顯著性升高；(2)抗阻訓練后24 h，H-RT組CD4+T淋巴細胞凋亡遷移和凋亡顯著性增加，而E-RT組僅凋亡增加；(3)E-RT組和H-RT組訓練后即刻以及訓練后24 h，CD8+T淋巴細胞遷移和凋亡均顯著性升高。因此，本研究結果部分證實了前述假設，提示僅CD4+T淋巴細胞對于抗阻訓練的反應具有運動方案依賴性。

對于CD4+T淋巴細胞，本研究發現，抗阻訓練后即刻H-RT組遷移和凋亡標志物(CX3CR1和annexin V)表達量均顯著上調，而E-RT組只有細胞遷移增加；訓練后24 h，H-RT組遷移和凋亡仍處于較高水平，而E-RT組僅凋亡增加，提示CD4+T細胞對于急性抗阻訓練的免疫應答反應存在運動方案依賴性，這與Navalta等[12]和Pereira等[3]的研究結果基本一致。然而Simpson等[13]發現，一次急性下坡跑(肌肉離心運動)運動后淋巴細胞減少主要是由于細胞遷移造成的，而與細胞凋亡無關，研究結果不一致可能與運動模型不同有關。在Navalta等[12]針對不同強度跑臺運動的研究中，以76%最大攝氧量(maximal oxygen uptake，VO2max)運動后1 h細胞凋亡明顯增加(運動后即刻無顯著性變化)，而運動強度為87%和100%時細胞遷移上調，提示中等強度運動誘導細胞凋亡，而高強度運動時由于細胞遷移顯著增加從而將凋亡的CD4+T細胞從血循環中清除。這與本研究中E-RT組的結果類似，即抗阻訓練后即刻CD4+T僅細胞遷移升高。Pereira等[3]設計旨在促進肌肉肥大的抗阻訓練方案(75%1RM，與本研究70%1RM接近)并對比不同組間間歇(1 minvs. 3 min)對CD4+T細胞遷移和凋亡的影響，結果發現，長間歇時(3 min)運動后即刻CD4+T細胞凋亡并無顯著性改變，而短間歇(1 min)則誘導凋亡和遷移標志物均表達上調。Asano等[9]以未經系統訓練的青年男性為受試對象，設計與本研究相似的兩種抗阻訓練方案并對比不同訓練方案對生理反應影響的差異，結果發現，肌肉肥大訓練方案誘導的心血管反應(心率、血壓)以及代謝標志物(血乳酸和肌酸激酶含量)均顯著高于肌肉耐力訓練方案。雖然本研究并未檢測上述參數，然而可以推測，H-RT組誘導的機械和代謝應激理應高于E-RT組，進而對免疫系統產生更為深刻的作用。Krüger等[2]的實驗結果顯示，以75%1RM強度進行一次急性抗阻訓練后淋巴細胞凋亡率和血清皮質醇含量顯著升高，體外細胞培養進一步證實，加入米非司酮(糖皮質激素受體拮抗劑)后凋亡率明顯減輕，提示皮質醇-糖皮質激素受體依賴性信號途徑參與并介導高強度抗阻訓練誘導外周血淋巴細胞凋亡。多項研究均證實，皮質醇含量升高誘導淋巴細胞遷移和/或凋亡是運動后淋巴細胞減少的重要原因。Smilios等[14]設計三種抗阻訓練方案(最大力量、肌肉肥大和肌肉耐力)旨在探討訓練組數對于睪酮、皮質醇和生長激素(growth hormone，GH)的影響，結果發現，肌肉肥大訓練方案誘導皮質醇和GH含量上調且高于其他兩種方案。該研究在一定程度上部分解釋了本研究中不同抗阻訓練方案凋亡和遷移存在差異的原因。

關于CD8+T淋巴細胞，本研究發現，H-RT和E-RT組訓練后即刻以及訓練后24 h細胞凋亡和遷移均顯著性升高。β-腎上腺素能受體(β-adrenergic receptor，β-AR)主要存在于細胞毒性T(如自然殺傷細胞和CD8+T)細胞，腎上腺素通過β-AR途徑而動員淋巴細胞[15]，腎上腺素灌注或使用β-腎上腺素能激動劑能夠選擇性上調細胞毒性T細胞β-AR表達[16]，因此CD8+T細胞易受腎上腺素的調節，從而導致CD8+亞群對于運動應激的反應較CD4+亞群更為敏感。Navalta等[12]等利用遞增負荷力竭運動試驗證實，運動后即刻CD8+T細胞CX3CR1表達量上調，而annexin V則無顯著性變化。研究結果存在差異可能與運動方式(有氧運動vs. 抗阻訓練)有關，而有氧運動和抗阻訓練時機體承受運動應激的方式不同(持續性vs. 間歇性)抑或是原因之一。Pereira等[3]設計組間間歇為1 min和3 min的旨在促進肌肉肥大的訓練方案并發現，訓練后即刻CD8+T細胞凋亡和遷移均顯著性增加。本研究對運動后恢復期多個時間點進行觀察并進一步證實，訓練后細胞凋亡與遷移在兩組間并無顯著性差異，提示CD8+T細胞對于不同抗阻訓練方案存在相似的免疫應答反應。

4 結論

本研究結果提示，CD4+T細胞對于急性抗阻訓練的反應存在運動方案依賴性。鑒于淋巴細胞不同亞群對于不同強度抗阻訓練的免疫反應規律，可以推測，進行以促進肌肉肥大為目的的抗阻訓練方案在運動后恢復期(24 h)能夠同時抑制CD4+T和CD8+T細胞介導的免疫反應，進而降低該時期內其對于抗原刺激的敏感性，而以改善肌肉耐力為目的的抗阻訓練方案誘導CD8+T細胞產生更為劇烈的免疫反應，上述規律為制定科學合理的抗阻訓練處方提供了理論依據。今后的研究應進一步揭示本研究結果的臨床意義，此外對于參訓者特別是初學者在制定抗阻訓練處方時應充分考慮運動誘導免疫反應這一因素，以避免或降低運動性免疫抑制的發生。