CPI203抑制腎癌ACHN細胞增殖及其機制

梁瓊仙，胡 波，張海紅，譚曉軍廣東省開平市中心醫院腎內科，廣東 開平 59300；暨南大學附屬第一醫院//廣州華僑醫院腎內科，廣東 廣州 50000

腎細胞癌是眾多惡性腫瘤中的一種，男性腎癌患者患病率約為女性患者的2倍，屬于泌尿生殖系統中的高發惡性腫瘤[1-2]。近年來，腎癌的檢出率逐年增加[3-4]。目前針對腎癌的治療方案主要為外科手術治療，但是術后腫瘤復發及轉移是阻礙腎癌治療進展的絆腳石，甚至20%的初診腎癌患者已為腫瘤晚期，錯失手術治療的最佳良機[5]。化療、放療為惡性腫瘤的重要治療方案，與外科手術切除療法并駕齊驅，但腎癌對放療及系統療法（基于IL-2及IFN-γ的激素療法、化學療法及免疫療法）不敏感甚至耐藥，大大增加治療難度[2,6]。BET超家族包括BRD1、BRD2、BRD4及BRDT 4種蛋白質，具有相似的空間結構，可通過結合染色體上乙酰化的賴氨酸介導染色體重排或調控轉錄活性[7-8]。研究發現BET超家族蛋白在腎癌細胞中表達量高，促進腎癌細胞增殖、侵襲及遷移，是治療腎癌的一個潛在靶點[9]。CPI203是一種BET超家族的特異性小分子抑制劑，前期研究發現CPI203可在體內外抑制多種惡性腫瘤細胞增殖，其中包括淋巴瘤、急性白血病、多發性骨髓瘤、皮膚鱗癌及神經內分泌腫瘤等[10-14]。CPI203小分子抑制劑可通過調控多種癌基因表達水平進而影響惡性腫瘤細胞的增殖、生長及侵襲。至今，暫未發現有關于CPI203對腎癌細胞增殖影響的研究。本實驗通過探索CPI203對腎細胞癌的殺傷作用，并針對其影響機制進一步深究，為探尋腎癌新藥物治療夯實一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

ACHN細胞（ATCC），小分子抑制劑CPI203（Selleckchem），PBS緩沖液、DMEM培養基、胎牛血清、普通胰酶等試劑（BI），熒光定量PCR引物（上海生工生物工程公司合成提供），CCK-8檢測試劑盒（Dojindo），逆轉錄及TBGreen試劑盒（Takara），免疫印跡實驗抗體（ProteinTech）。

1.2 細胞培養

腎癌ACHN細胞以普通培養基（含10%FBS的DMEM）于37 ℃、5% CO2飽和濕度細胞培養箱中培養，嚴密注意細胞生長情況，當細胞增殖至密度達培養瓶80%左右時，傳代培養。后續所有細胞實驗均建立在對數生長期狀態良好的細胞上進行實驗。

1.3 小分子抑制劑CPI203藥物溶液配制

CPI203用細胞級別的DMSO充分溶解，先配制成100 μmol/L濃度的母液并保存于-80 ℃冰箱中。細胞實驗前用完全培養基將藥物母液稀釋成實驗需要的工作液濃度。

1.4 腎癌ACHN細胞存活率檢測

取生長狀態良好的ACHN細胞，經胰酶消化后調整細胞密度為5×104/mL，以每孔100 μL的細胞懸液接種于96孔板中，將培養板置于細胞孵箱中培養過夜。根據實驗計劃需求，將培養板中的細胞培養基更換為CPI203藥物溶液，濃度分別為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L，設立空白組及對照組，每個濃度設立4個復孔。CPI203藥物作用于腎癌ACHN細胞24、48 h后，96孔板中每個孔按照CCK8試劑盒說明書指示加入10 μL CCK8溶液，將96孔板放入細胞孵箱中繼續培養4 h，酶標儀檢測培養板吸光度A450nm并計算細胞存活率。

1.5 細胞劃痕實驗

取生長狀態良好的ACHN細胞備用，將腎癌細胞懸液密度調整為1×106/mL，以1 mL/孔的細胞懸液接種于6孔板中，放回普通細胞孵箱中繼續培養至細胞密度達培養板的90%～100%時，用高壓滅菌過的200 μL中槍頭迅速地在細胞中劃痕，然后將細胞培養基更換為CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養基。分別于藥物作用0、48 h后于倒置顯微鏡下拍照，觀察細胞遷移及侵襲能力。

1.6 細胞周期實驗

取生長狀態良好的ACHN細胞備用，將腎癌細胞懸液密度調整為1×106/mL，以1 mL/孔的細胞懸液接種于6孔板中，將培養板放回孵箱中繼續培養24 h后將細胞培養基更換為小分子抑制劑CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養基，將培養板放回細胞孵箱繼續培養24 h后收集細胞，充分洗滌后加入75%乙醇固定液固定，放置于4 ℃冰箱過夜。PBS充分洗滌后加入500 μL PI重懸細胞，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.7 細胞凋亡實驗

取生長狀態良好的ACHN細胞備用，將腎癌細胞懸液密度調整為1×106/mL，以1 mL/孔的細胞懸液接種于6孔板中，將培養板放回孵箱中繼續培養24 h后將細胞培養基更換為小分子抑制劑CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養基，將培養板放回細胞孵箱繼續培養24 h后收集細胞，用PBS充分清洗后加入100 μL bindingbuffer重懸細胞，然后分別加入APC和PI各5 μL，常溫下避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8 細胞克隆形成實驗

取生長狀態良好的ACHN細胞以500/孔接種于6孔板中，細胞繼續于孵箱中培養24 h后將細胞培養基更換為小分子抑制劑CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養基，將細胞放回孵箱中繼續培養10 d后用PBS充分洗滌，細胞固定液固定1 h后充分清洗，倒置顯微鏡下計算克隆形成數目。

1.9 免疫印跡法檢測MYC、GSK3β、ERK、AKT、CyclinD1和NOXA蛋白水平

收集不同CPI203藥物濃度處理的腎癌ACHN細胞并充分洗滌，加入適量強效細胞裂解液，4 ℃條件下裂解20 min，提取全細胞蛋白并利用BCA法測定蛋白濃度。提前配制好適宜濃度的SDS-PAGE膠，每個泳道加入40 μg蛋白，80 V恒壓電泳約30 min后轉換為120 V恒壓電泳約1 h；恒流200 mA濕轉法轉膜；將PVDF膜置于5% BSA溶液中封閉2 h；分別將PVDF膜置于4 ℃冰箱中中孵育相應一抗溶液，過夜；0.1%吐溫的TBS-T洗滌一抗4次，10 min/次；室溫下孵育二抗1 h；TBS-T漂洗二抗3次，6 min/次；將PVDF膜稍微瀝干后加入ECL發光液，放置于WB成像系統中顯影成像。

1.10 qRT-PCR

用TRIzol裂解細胞并按照試劑盒說明書指示提取細胞總RNA，嚴格按照TaKaRa逆轉錄試劑盒及TBGreen說明書將總RNA逆轉錄成cDNA并進行熒光定量檢測。qRT-PCR引物序列見表1。內參基因選用GAPDH，利用2-ΔΔCt法分析結果。

1.11 統計方法

對計數資料及計量資料均采用雙側檢驗分析，采用SPSS20.0軟件統計數據，參數檢驗及非參數檢驗分別采取t檢驗和χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1 CPI203抑制腎癌ACHN細胞增殖

不同濃度CPI203藥物作用于ACHN細胞48 h后，腎癌細胞增殖活性受到不同程度抑制（表2）。0.1～5 μmol/L濃度的CPI203作用于ACHN細胞24 h后細胞增殖活性從87.29%降至52.61%，相同濃度的CPI203藥物作用于腎癌ACHN細胞的時間越長，細胞增殖活性下降（P＜0.05，表2）。

表2 CCK8法檢測CPI203抑制ACHN細胞增殖效果（%，Mean±SD）

2.2 CPI203抑制腎癌ACHN細胞侵襲及遷移能力

ACHN細胞劃痕實驗結果表明，隨著CPI203藥物濃度的增大，細胞遷移距離明顯變小（P＜0.05，圖1）。

圖1 ACHN細胞劃痕實驗

2.3 CPI203藥物抑制腎癌ACHN細胞生長周期并促進其凋亡

不同濃度小分子抑制劑CPI203作用于腎癌ACHN細胞24 h后其細胞周期及凋亡情況。實驗結果顯示，小分子抑制劑CPI203濃度越大，ACHN細胞G0/G1期比例增加，G2/M和S期占比均比對照組細胞小，細胞凋亡率也隨著藥物濃度增大而升高（P＜0.05，圖2）。

2.4 熒光定量PCR

CPI203作用于腎癌ACHN細胞后減弱MYC基因、NOXA基因、AKT基因、ERK基因、GSK3β基因及CyclinD1基因的表達量（P＜0.05，圖3）。

2.5 CPI203抑制腎癌ACHN細胞克隆形成能力

未加小分子抑制劑CPI203的ACHN細胞形成明顯的細胞克隆集落，隨著藥物濃度的增大，腎癌ACHN細胞克隆集落形成能力逐漸減弱（P＜0.05，圖4）。

2.6 Western blotting結果

CPI203作用于腎癌ACHN細胞后降低MYC蛋白、NOXA蛋白、AKT蛋白、ERK蛋白、GSK3β蛋白及CyclinD1蛋白的表達量（P＜0.05，圖5）。

圖2 不同濃度CPI203藥物對腎癌ACHN細胞周期（A）及凋亡（B）的影響*P＜0.05

圖3 小分子抑制劑CPI203作用于腎癌ACHN細胞后相關基因表達的影響

圖4 不同濃度CPI203藥物對腎癌ACHN細胞克隆形成能力的影響

圖5 小分子抑制劑CPI203作用于腎癌ACHN細胞后相關蛋白表達的影響

3 討論

腎癌細胞對化療和放療敏感性弱，并且患者病情容易出現復發難治，眾多科學家為了克服此困難一直致力于探索治療腎癌的新藥物[15-17]。文獻報道CPI203具有抑制胰腺神經內分泌腫瘤增殖，促進其癌細胞凋亡并將腫瘤細胞抑制于細胞周期G1期，從而對腫瘤細胞發揮殺傷作用[15]。本研究同樣發現小分子抑制劑CPI203具有抑制腎癌ACHN細胞生長增殖能力，并且其抑制效果與藥物作用時間呈正相關性。CPI203小分子抑制劑具有抑制腎癌ACHN細胞侵襲、遷移的能力，表明該小分子抑制劑在體內具有抑制腎癌腫瘤發生轉移的能力。流式細胞儀檢測結果表明隨著CPI203藥物濃度的增加，腎癌ACHN細胞發生凋亡的比例增大，表明腫瘤細胞的凋亡率與CPI203藥物呈濃度依賴性。細胞周期相關蛋白CyclinD1是一種重要的細胞周期素，嚴格地調控著細胞G1期的合成，主要作用于G1/S調定點并調控著細胞G1期向S期的進展。CyclinD1過多將縮短G1期，細胞將減弱對外源性有絲分裂的依賴并進入細胞分裂[18]。CyclinD1下降將把細胞周期抑制于G1期，有利于腫瘤的治療。

本實驗結果表明，小分子抑制劑CPI203可抑制腎癌ACHN細胞CyclinD1的表達，細胞S期及G2/M期比例降低，G0/G1期比例升高，表明CPI203可阻滯腎癌ACHN細胞周期進展，影響腫瘤細胞的生長、生存。有研究發現CPI203可通過降低MYC、NOXA、AKT及ERK等眾多基因的表達從而抑制多發性骨髓瘤細胞及淋巴瘤細胞的增殖[19]。本研究發現小分子抑制劑CPI203通過抑制腎癌ACHN細胞GSK3β、CyclinD1、MYC、NOXA、AKT及ERK基因的轉錄活性，減少其mRNA的表達量，同時降低這些基因的翻譯活性，進一步抑制GSK3β、CyclinD1、MYC、NOXA、AKT及ERK蛋白質的生成及功能。

綜上所述，CPI203能夠殺傷腎癌ACHN細胞，抑制腎癌細胞生長周期進展，其潛在涉及的機制可能通過影響MYC、NOXA、AKT、ERK、GSK3β、CyclinD1等基因的表達有關。所以，CPI203是治療腎癌的潛在新藥物，為腎癌治療方案的選擇開辟出新道路。