圍生期磺胺間甲氧嘧啶暴露對(duì)海馬mTOR信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制的影響

祝一田 劉心記 魏嶸 張強(qiáng) 陶振男 劉開永,2,*

(1 安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，合肥 230032；2 人口健康與優(yōu)生安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032)

2013年中國(guó)抗生素使用量達(dá)到162000噸，其中52%為獸用[1]。磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine,SMM)作為我國(guó)生產(chǎn)量和使用量最大的獸用抗生素之一，在牛奶、雞肉等動(dòng)物性食品中均有檢出[2-3]，并通過(guò)多種途徑在人體內(nèi)殘留。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，圍生期母鼠暴露SMM可導(dǎo)致子鼠脂肪沉積，肝臟、腎臟受損以及表現(xiàn)出焦慮，記憶障礙等異常行為[4-5]。研究表明，抗生素暴露是誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)的主要因素[6]，可通過(guò)影響短鏈脂肪酸(SCFAs)等菌群代謝物引起腸-腦軸交流障礙，進(jìn)而影響宿主行為和腦功能[7]。大腦海馬中mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)控制著神經(jīng)系統(tǒng)的許多生理功能，包括神經(jīng)發(fā)育，記憶和認(rèn)知等，如mTOR信號(hào)的過(guò)度活化可以降低小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力[8]，與課題組前期研究雌性子鼠腦組織中mTOR相關(guān)基因的mRNA表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致[4]，mTOR信號(hào)下調(diào)也會(huì)誘導(dǎo)大鼠表現(xiàn)出焦慮樣行為[9]，但SMM暴露是否對(duì)mTOR信號(hào)表達(dá)有長(zhǎng)期影響，及其通過(guò)影響腸道菌群代謝而改變精神行為的mTOR調(diào)控機(jī)制尚未明確。本研究探討圍生期母鼠SMM暴露對(duì)糞便中SCFAs含量及子鼠海馬mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器

GC 7890型氣相色譜儀，Agilent Technologies Co.ltd.；Centrifuge 5417高速低溫離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；色譜柱：DB-FFAP，30m，0.25mm，0.25μm，美國(guó)Agilent公司；凝膠成像分析系統(tǒng)Tanon6600、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽VE-186和蛋白質(zhì)電泳槽VE180均購(gòu)于北京天能公司。

1.2 試劑

SMM原料藥(有效成分含量為99.8%)，安徽華澳生物技術(shù)有限公司；總蛋白BCA測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；所用抗體均購(gòu)于英國(guó)的Abcam公司；乙酸、丙酸、丁酸和2-乙基丁酸(內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)品，上海Sigma-Aldrich公司。

1.3 動(dòng)物的來(lái)源與處理

I C R小鼠(S P F級(jí)，8周齡)購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001)，雄鼠20只，雌鼠40只，雄鼠體重(30±2)g，雌鼠為(25±2)g。實(shí)驗(yàn)前允其有1周的環(huán)境適應(yīng)期，然后按照常規(guī)飼養(yǎng)。晚9點(diǎn)，按雌:雄=2:1進(jìn)行合籠，次日早上7點(diǎn)查到陰栓者確定受孕，記為懷孕第1天(GD 1)。母鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、低(Low)、中(Middle)、高(High)劑量組，從GD 1至PND 21，對(duì)每組10只母鼠分別灌胃給予生理鹽水和10、50、200mg/kg劑量的SMM，給藥頻率為每天1次，給藥體積為每100g體重的小鼠給予1mL的生理鹽水或不同劑量的SMM。母鼠在PND 22時(shí)剖殺，留存其糞便冷凍保存(-80℃)。雌性子鼠分別在PND 22和PND 56時(shí)剖殺，取其海馬組織冷凍保存(-80℃)。

1.4 短鏈脂肪酸的測(cè)定

高效氣相色譜法測(cè)定糞便中短鏈脂肪酸(SCFAs)的含量，具體步驟依據(jù)參考文獻(xiàn)[10]略有改動(dòng)，簡(jiǎn)述如下，稱取糞便樣品0.06g于1.5mL離心管中，加入600μL的去離子水浸泡12h，13000r/min離心15min，取上清液100μL，加入內(nèi)標(biāo), 以5mol/L HCl 10μL混均，待進(jìn)樣。

1.5 mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測(cè)

蛋白免疫印跡法測(cè)定mTOR相關(guān)蛋白磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、小G蛋白R(shí)as同源蛋白(Rheb)、海馬雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)和4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)的表達(dá)，具體步驟依據(jù)參考文獻(xiàn)[10]，略有改動(dòng)，簡(jiǎn)述如下，先進(jìn)行總蛋白的提取，然后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉與抗體孵育，最后顯影和凝膠圖像分析測(cè)定蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，所有參數(shù)采用單因素方差分析，各組之間采用最小顯著差法(LSD)兩兩比較，與對(duì)照組相比，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.001)。

2 結(jié)果

2.1 母鼠糞便中SCFAs含量及比例

如圖1所示，與對(duì)照組相比，PND 22時(shí)，各處理組的總SCFAs含量(乙酸、丙酸和丁酸總含量)、丁酸和中劑量組丙酸含量均顯著下降(P＜0.05)。各處理組丁酸與乙酸及與丙酸含量的比值和中、高劑量組丙酸與乙酸含量的比值明顯降低(P＜0.05)。

2.2 雌性子鼠海馬組織PI3K、Akt的表達(dá)

如圖2所示，PND 22時(shí)，PI3K表達(dá)在各劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，各處理組Akt表達(dá)顯著增高(P＜0.05)；PND 56時(shí)，各處理組PI3K和低、中劑量組Akt表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。

圖1 母鼠糞便中SCFAsFig.1 Fecal SCFAs of the dams

圖2 雌性子鼠海馬組織PI3K、Akt的表達(dá)Fig.2 The expression of PI3K and Akt in the female offspring hippocampus

2.3 雌性子鼠海馬組織Rheb、mTOR的表達(dá)

如圖3所示，PND 22時(shí)，各處理組Rheb、mTOR表達(dá)顯著增高(P＜0.05)；PND 56時(shí)，各處理組mTOR表達(dá)及中，高劑量組Rheb表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。

2.4 雌性子鼠海馬組織S6K1的表達(dá)

如圖4所示，PND 22時(shí)，高劑量組S6K1表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，PND 56時(shí)，中、高劑量組S6K1表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。

2.5 雌性子鼠海馬組織4EBP1的表達(dá)

如圖5所示，PND 22時(shí)，低、中劑量組4EBP1表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。PND 56時(shí)，低、中、高劑量組4EBP1表達(dá)仍顯著增高(P＜0.05)。

以上結(jié)果說(shuō)明，圍生期暴露SMM導(dǎo)致母鼠糞便中SCFAs含量顯著下降，比值差異增大，并誘導(dǎo)雌性子鼠海馬mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生改變，對(duì)mTOR信號(hào)表達(dá)有長(zhǎng)期影響。

3 討論

圖3 雌性子鼠海馬組織Rheb、mTOR的表達(dá)Fig.3 The expression of Rheb and mTOR in the female offspring hippocampus

圖4 雌性子鼠海馬組織S6K1的表達(dá)Fig.4 The expression of S6K1 in the female offspring hippocampus

圖5 雌性子鼠海馬組織4EBP1的表達(dá)Fig.5 The expression of 4EBP1 in the female offspring hippocampus

隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，為了預(yù)防和治療疾病以及提高飼料報(bào)酬率，多種抗生素被廣泛使用，以致動(dòng)物性食品中抗生素殘留。一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果顯示，磺胺類抗生素在雞肉和豬肉中殘留量可達(dá)2700和3600μg/kg[11]。本次研究中低劑量組SMM給藥量為10mg/kg，研究結(jié)果顯示，母鼠糞便短鏈脂肪酸含量以及子鼠mTOR信號(hào)表達(dá)在低劑量組即可發(fā)生改變。有研究表明，飼喂有微量抗生素殘留的牛奶即可對(duì)小牛的腸道菌群功能帶來(lái)顯著改變[12]，說(shuō)明抗生素暴露尤其是生命早期暴露會(huì)引起宿主腸道菌群失衡[13]。

動(dòng)物研究顯示，阿奇霉素等廣譜抗生素處理過(guò)的大鼠糞便中SCFAs總量、類型和分布都發(fā)生明顯的改變[14]。此外，生命早期抗生素暴露誘導(dǎo)小鼠腸道微生物代謝及結(jié)構(gòu)改變，對(duì)其腦神經(jīng)化學(xué)和行為學(xué)有長(zhǎng)期不良影響[15]，提示SCFAs含量及比例可以間接反映腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化[16]，通過(guò)影響腸-腦軸，介導(dǎo)菌群變化與精神行為異常之間的關(guān)聯(lián)[17]。本研究中母鼠糞便總SCFAs和丁酸含量在各劑量組均顯著降低，說(shuō)明SMM暴露可改變母鼠腸道微生物的代謝。母體孕期的腸道微生物組對(duì)嬰兒腸道微生物的定殖與發(fā)育有重要的影響，且有動(dòng)物研究表明，孕鼠菌群的改變可傳遞給后代并長(zhǎng)期持續(xù)[18]，據(jù)此可推測(cè)實(shí)驗(yàn)中子鼠的腸道菌群穩(wěn)態(tài)也發(fā)生變化，盡管我們并沒(méi)有檢測(cè)子代腸道菌群相關(guān)指標(biāo)。此外，將正常小鼠的糞便微生物移植給帕金森氏癥(PD)鼠，發(fā)現(xiàn)PD小鼠的腸道菌群失調(diào)和身體損傷減緩[19]，說(shuō)明SMM暴露可能通過(guò)腸-腦軸對(duì)小鼠精神行為產(chǎn)生影響，與本研究中母鼠糞便中短鏈脂肪酸含量降低，前期研究結(jié)果子鼠出現(xiàn)記憶認(rèn)知障礙結(jié)果一致[4]。

研究表明，SCFAs可通過(guò)rS6磷酸化的CD4+T細(xì)胞激活mTOR通路[20]，同時(shí)，SCFAs抑制B細(xì)胞中的AMPK(AMP依賴的蛋白激酶)信號(hào)從而改變mTOR信號(hào)[21]。這些研究提示雌性子鼠海馬mTOR信號(hào)的改變可能與其糞便中SCFAs含量改變有關(guān)。課題組前期結(jié)果顯示，雌性子鼠大腦中mTOR上下游信號(hào)基因的mRNA表達(dá)異常，且圍生期暴露SMM對(duì)雌鼠神經(jīng)行為學(xué)影響更為嚴(yán)重，有性別差異[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)雌性子鼠海馬組織中mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，在PND 22時(shí)，Akt、mTOR、S6K1和4EBP1的蛋白表達(dá)明顯升高，且與藥物劑量無(wú)明顯相關(guān)性。雌性子鼠在出生前至PND 21持續(xù)間接暴露于SMM。有研究發(fā)現(xiàn)，低劑量抗生素暴露能夠增加脂肪沉積，具有促生長(zhǎng)作用，在前期實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)子鼠體重增加，因此我們推測(cè)雌性子鼠間接暴露SMM時(shí)，腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，mTOR信號(hào)上調(diào)可能是對(duì)SMM暴露的代償性升高。而在PND 56，即雌性子鼠停止SMM暴露5周時(shí)，mTOR上游信號(hào)Akt和PI3K，以及mTOR蛋白表達(dá)下降，mTOR通過(guò)磷酸化和鈍化轉(zhuǎn)化抑制劑4E-BP，激活S6激酶(S6K)來(lái)控制蛋白質(zhì)的合成[23]，與PND 56時(shí)S6K1蛋白表達(dá)下降，4EBP1蛋白表達(dá)升高結(jié)果一致，說(shuō)明停止暴露后mTOR信號(hào)并未恢復(fù)到正常水平，SMM暴露對(duì)mTOR信號(hào)表達(dá)有長(zhǎng)期影響。mTOR信號(hào)中Akt是一種蛋白激酶，對(duì)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，存活以及代謝有重要作用[24]，此外，mTOR分子參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展的多個(gè)過(guò)程，除有蛋白激酶功能外，還是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在大腦的形成和發(fā)育、神經(jīng)突觸的發(fā)生、學(xué)習(xí)和記憶的形成中起重要作用[25]。本研究中，雌性子鼠海馬中Rheb表達(dá)在PND 22時(shí)顯著增高，作為mTOR的上游激活蛋白，Rheb的超表達(dá)可抑制神經(jīng)元的遷移，影響神經(jīng)元的形態(tài)和小鼠大腦皮層的發(fā)育[26]，與課題組前期研究結(jié)果子鼠記憶受損一致。mTOR信號(hào)通路的改變可能與一些引起宿主行為改變的神經(jīng)性疾病密切相關(guān)[27]，mTOR信號(hào)下調(diào)會(huì)對(duì)神經(jīng)活性產(chǎn)生一定的影響，如雷帕霉素(mTOR抑制劑)處理過(guò)的大鼠表現(xiàn)出焦慮樣行為[9]，說(shuō)明mTOR信號(hào)通路的改變可能引起不良健康結(jié)局，如前期研究結(jié)果中子鼠行為異常可能與此有關(guān)。

腸道菌群可通過(guò)與大腦交流誘導(dǎo)腦神經(jīng)化學(xué)及行為的改變[28]，且腸道微生物組成的改變會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能[29]，短鏈脂肪酸可通過(guò)調(diào)節(jié)大腦中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子影響mTOR信號(hào)[30]，與本實(shí)驗(yàn)短鏈脂肪酸含量降低，mTOR信號(hào)通路改變結(jié)果一致，有關(guān)更為詳細(xì)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上所述，圍生期母鼠暴露于SMM后，糞便SCFAs含量顯著降低、從而誘導(dǎo)雌性子鼠海馬mTOR信號(hào)通路發(fā)生改變。