ε-聚賴氨酸對白念珠菌抑菌活性及機制研究

余甜 時文靜 謝躍 李可可 鄒鳳梅 劉剛 李軍春 張興旺 魏蓮花,*

(1 甘肅中醫藥大學，蘭州 730000；2 寧夏醫科大學，銀川 750004；3 甘肅省人民醫院檢驗中心，蘭州 730000)

白念珠菌(Candida albicans)，又稱白假絲酵母菌，廣泛存在于自然界，多寄生于人體皮膚、黏膜、口腔，上呼吸道以及陰道等部位，正常情況下酵母相在顯微鏡下呈圓形或者橢圓形，與機體處于共生狀態，屬于機會性致病菌。近年來，隨著艾滋病、惡性腫瘤患者的增多，導尿管或靜脈置管及內鏡微創技術的開展，高效廣譜抗生素、器官移植術后免疫移植抑制劑、以及激素的應用等多種因素，真菌感染已經是臨床不能忽視的重要問題，而白念珠菌為代表的念珠菌病是其中的熱點問題[1]。生物膜是白念珠菌一個重要致病因子。研究表明，與浮游細胞相比，生物膜形成的基質-胞外多聚化合物(EPS)具有強大的屏障作用，因而對抗菌劑耐藥性更強[2]。ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是天然抗菌物質，對許多細菌和真菌均有較好的抑制作用，但關于ε-PL對白念珠菌的抑制作用文獻幾乎沒有報道[3]。本研究以白念珠菌為研究對象，測定ε-聚賴氨酸對白念珠菌的抑菌活性，以及對白念珠菌生物膜抑制作用，初步探究其抑菌機制，為臨床抗真菌藥物的研發提供新思路。

1 材料

1.1 菌株

標準菌株(ATCC64548和ATCC64550)由甘肅省人民醫院檢驗中心微生物實驗室保存，50株臨床菌株由甘肅省人民醫院檢驗中心從陰道、糞便、痰、肺泡灌洗液等標本中分純，使用質譜儀鑒定為白念珠菌，紙片法-80℃保存。

1.2 試劑

ε-聚賴氨酸(鄭州拜納佛生物工程股份有限公司)，沙保弱培養基(英國，Oxoid)、RPMI1640液體培養基(美國，Gibco)，結晶紫染料(珠海迪爾生物工程有限公司)，酵母菌提蛋白試劑盒(上海生工)，活性氧(ROS)測定試劑盒(萬類生物)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(萬類生物)，BCA總蛋白測定試劑盒(索萊寶)。

1.3 設備

德國布魯克(MALDI-TOF)飛行質譜儀，酶標儀(瑞士Sunrise)，紫外分光光度計(上海菁華科技有限公司)，熒光顯微鏡(日本，Olympus)。

2 方法

2.1 MIC和MFC測定

采用CLSI-M27文件中微量稀釋法測定抗真菌藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)，質控菌株為近平滑念珠菌(ACTT22019)，使用酶標儀讀取MIC值[4]，以真菌抑制百分數為80%的最小濃度孔為真菌的MIC。將MIC實驗中每株菌的不同孔培養混合物涂布在沙保弱培養基上，25℃培養48h后無菌落形成的最小藥物濃度即為最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration, MFC)。

2.2 SMIC50測定

使用結晶紫染色法篩選白念珠菌標準菌株(ATCC64548和ATCC64550)和50株臨床中具有生物膜形成能力的菌株。在篩選出具有生物膜能力菌株中隨機抽取16株臨床菌株以及1株標準菌株，進行SMC50測定實驗。SMIC50測定方法參考馮凡等[5]實驗方法制備生物膜模型后，分別在實驗孔和空白對照孔加入藥液和培養基，37℃，75r/min震蕩培養48h后，干燥固定后結晶紫染色3h，蒸餾水沖洗直至無色，干燥2h后每孔150μL加入30%冰醋酸，待其完全溶解后測A590值。生物膜抑制百分數為50%的最小濃度孔為真菌的SMIC50。

2.3 浮游菌株時間生長曲線和生物膜時間生長曲線

浮游菌株時間生長曲線：將保存的白念珠菌標準菌株(ATCC64548和ATCC64550)活化后，使用RPMI1640將其稀釋成2×106CFU/mL，然后稀釋100倍使其濃度變成2×104CFU/mL，將菌懸液中加入不同濃度ε-PL，37℃，200r/min 震蕩培養，分別在不同時間點吸取各體系中100μL液體，加入96孔板中測定吸光度A590值，并繪制時間生長曲線。

生物膜時間生長曲線：將保存的白念珠菌標準菌株(ATCC64548和ATCC64550)使用“2.2”項方法制備生物膜模型后，加入100μL的RPMI 1640培養基和100μL不同濃度的ε-PL，37℃，75r/min震蕩培養，不同時間點測定生物膜形成情況(方法同“2.2”項)，并繪制時間生物膜抑制-時間曲線[6]。

2.4 ε-PL對菌絲和芽管抑制作用

將保存的白念珠菌ATCC64548活化后，使用生理鹽水配制為2×106CFU/mL，取菌液500μL加入到含4mL牛血清試管中，再加入不同的濃度藥物500μL，37℃恒溫中200r/min震蕩培養，每隔2h取一接種環的培養物涂布在玻片上，顯微鏡下觀察并測定菌絲的長度及平均值。芽管生長的判斷標準：計數芽管形成百分率時，芽管生長的長度超過菌體直徑2倍以上為正常生長芽管；芽管長度低于菌體直徑2倍者，認為芽管受抑制。計數過程中使用OLYMPUS顯微鏡系統上測定有正常生長芽管長度，每次3個人同時測定芽管長度及計數[7]。

2.5 測定ε-PL誘導白念珠菌產生活性氧(ROS)含量

將活化后白念珠菌標準菌株ATCC64548配置成2×106CFU/mL后，取500μL加入到含4mL的RPMI1640培養基中，再加入不同的濃度藥物500μL，37℃恒溫中200r/min震蕩培養12h后，取菌懸液3mL，3000r/min離心10min，收集菌體，用PBS洗滌3次后，將菌體重懸于PBS中，濃度為2×106CFU/mL，取500μL重懸好的菌液，在暗室中加入5μL濃度為1mmol/L的DCFH-DA使終濃度為10μmol/L，渦旋震蕩均勻，于37℃培養孵育2h，每隔3～5min鐘震蕩混勻，使探針和菌體充分混勻。用5000g離心5min，收集菌體，用PBS洗滌1次，收集菌體沉淀后重懸于250μL PBS液中，混勻后取10μL置于玻片上，使用熒光顯微鏡觀察[8]。

2.6 測定ε-PL對白念珠菌的脂質氧化程度

白念珠菌ATCC64548活化后，使用生理鹽水配置成2×106CFU/mL，將菌株分成A組和B組，A組的處理方法與“2.6”項相同，B組在A組基礎上加入10mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)，將兩組讓37℃200r/min震蕩培養12h后，10000r/min離心5min收集菌體，采用酵母菌提蛋白試劑盒提取總蛋白，然后使用BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。采用脂質氧化(丙二醛，MDA)檢測試劑盒測定脂質氧化損傷情況，每組實驗重復3次[8]。

3 實驗結果

3.1 MIC和MFC以及SMIC50測定結果

ε-PL對白念珠菌標準菌株ATCC64548(氟康唑敏感株)、ATCC64550(氟康唑耐藥株)和50株臨床菌株的MIC80和MFC的濃度分別是512和1024μg/mL(表1和圖1)。在篩選具有生物膜形成能力菌株后，對隨機抽取的1株標準菌株和16株臨床菌株的生物膜抑制濃度SMIC50也為512μg/mL，此濃度下ε-PL對生物膜抑制率平均為58%。

表1 ε-PL對白念珠菌抑菌作用Tab.1 Antibacterial effect of ε-PL on Candida albicans

3.2 時間生長曲線及生物膜抑制時間曲線

用不同濃度ε-PL處理白念珠菌浮游菌株及生物膜，分別測定浮游菌的A590值及結晶紫法測定生物膜厚度，以繪制不同時間下藥物對浮游菌株和生物膜的抑制活性。結果顯示48h的生長周期中，ε-PL的對白念珠菌浮游菌株及生物膜均具有明顯抑制作用，抑制效果與藥物濃度呈現正相關，并且在氟康唑敏感株和耐藥株之間并無明顯差異。從兩組圖中可以明顯看出作用時間在12h前后，白念珠菌的浮游菌株及生物膜均表現出明顯抑制作用(圖2～3)。

3.3 ε-PL對菌絲和芽管抑制作用

白念珠菌的菌絲是其重要的毒力因子，在致病中發揮重要的作用。本實驗通過白念珠菌的出芽率及4h內的芽管長度衡量ε-PL對白念珠菌菌絲的抑制作用，并通過顯微鏡記錄了牛血清培養基中白念珠菌酵母相向菌絲相轉變情況[7]。實驗結果(圖4)表明MIC和MFC濃度下白念珠菌的芽管出芽率及長度的具有明顯的抑制作用，并且其抑制作用呈現劑量依賴(P＜0.05)；低濃度的ε-PL對菌絲沒有明顯抑制作用(P＞0.05)。顯微鏡下4h內芽管圖片結果(圖5)表明，空白組芽管在2h后可見大量菌絲的纏繞，MIC和MFC濃度下出芽率較低，幾乎均呈現酵母相；在4h時，低濃度組和空白組均出現菌絲，MIC和MFC芽管出芽率依舊保持低水平且芽管長度較小。

3.4 ε-PL對白念珠菌的氧脅迫作用

使用熒光探針DCFH-DA測定白念珠菌與不同濃度的ε-PL在37℃共培養12h后產生ROS的含量，研究ROS的氧化損傷與ε-PL濃度的關系。不帶熒光的DCFH-DA探針可以自由的進入細胞膜內，進入細胞膜后被細胞內的脂酶氧化為DCFH。而DCFH探針不能穿透細胞膜，會被細胞內產生的ROS生成有熒光的DCF，通過測定熒光的強度衡量ROS含量。如圖6所示，與空白組相比，不同濃度ε-PL作用于白念珠菌后產生的ROS的含量隨著濃度的升高而升高。當ε-PL濃度達到MIC時，ROS的生成率約占93.7%。

圖1 ε-PL對白念珠菌抑菌作用熱圖Fig.1 Heat map of antimony effect of gallium-PL on Candida albicans

圖2 不同濃度ε-PL對白念珠菌的生長的影響Fig.2 Effects of different concentrations of ε-PL on the growth of Candida albicans

圖3 不同濃度ε-PL對白念珠菌生物膜形成的影響Fig.3 Effects of different concentrations of ε-PL on biofilm formation of Candida albicans

圖4 不同濃度ε-PL對白念珠菌芽管長度(A)和芽管形成率(B)影響Fig.4 Effects of different concentrations of ε-PL on the tube formation rate (A) and tube length (B) of Candida albicans

圖5 不同濃度ε-PL對白念珠菌酵母-菌絲轉化影響Fig.5 Effects of different concentrations of ε-PL on the transformation of Candida albicans yeast-mycelium(×400)

3.5 ε-PL對白念珠菌脂質氧化損傷作用

為了進一步研究ROS和白念珠菌的膜氧化損傷的關系，分別測定“2.6”項實驗處理后MDA含量，以及在“2.6”項實驗基礎上加入抗氧化劑NAC后MDA含量。MDA是膜脂質過氧化的主要產物，也是白念珠菌膜系統遭受壓力重要標志之一。研究表明：不同濃度ε-PL均可引起白念珠菌膜出現脂質過氧化損傷(圖7)。用512μg/mL的ε-PL作用后，MDA含量是對照組7倍左右。在加入抗氧化劑前，MDA的含量與ε-PL濃度呈正相關。在加入抗氧化劑后，MDA含量與之前相比明顯下降。

圖6 不同濃度ε-PL作用白念珠菌后ROS含量(×200)Fig.6 ROS Content of Candida albicans after different concentrations of P-PL(×200)

圖7 不同濃度ε-PL作用白念珠菌后MDA含量Fig.7 MDA content in Candida albicans after different concentrations of P-PL

4 討論

近年來，隨著艾滋病及惡性腫瘤患者的增多，導尿管或靜脈置管及內鏡微創技術的開展，高效廣譜抗生素以及器官移植術后免疫移植抑制劑和激素的應用等多種因素，真菌感染已經是臨床不能忽視的重要問題，而白念珠菌為代表的念珠菌病是其中的熱點問題。從中國侵襲性真菌監測網(CHIF-NET)發布的數據來看(2009—2014年)：白念珠菌(3965株，44.9%)，近平滑念珠菌(1762, 20%)、熱帶假絲酵母(1515.17.2%)分列前3位。我國的真菌耐藥率高于世界水平：伏立康唑耐藥率顯著上升，耐藥率由19%上升至21.3%；伏立康唑交叉耐藥率從5.8%上升至6%[9]。其中生物膜形成是白念珠菌重要的耐藥原因，也是大部分白念珠菌深部感染出現慢性感染及復發的原因。ε-PL是一種天然抗菌肽，由于其廣譜的抗菌活性、無毒無味以及穩定性高等特點現廣泛應用于食品防腐中[10]。本研究通過實驗進一步證實ε-PL對白色念珠具有明顯抑菌作用，尤其是對其生物膜形成有顯著抑制作用，通過ROS和MDA測定初步證實ε-PL對白念珠菌的抑菌活性是通過氧脅迫發揮作用。

本研究首先通過微量稀釋法測定了白念珠菌MIC和MFC值，發現ε-PL在512μg/mL是可以抑制白念珠菌生長，菌懸液涂布法檢測結果表明1024μg/mL可完全殺死白念珠菌，因此可以確定其MIC和MFC值分別為512和1024μg/mL。實驗進一步繪制了ε-PL對白念珠菌作用下的時間生長曲線，結果表明ε-PL對白念珠菌的抑制作用呈現明顯的劑量依賴，并且在ATCC64548(氟康唑敏感株)和ATCC64550(氟康唑耐藥株)無明顯差異。SMIC50測定實驗結果表明ε-PL在512μg/mL ε-PL下可明顯抑制生物膜的形成，這表明ε-PL對生物膜的抑制作用較為顯著。曾貝妮[11]在舒洛地爾對白念珠菌生物膜抑制作用研究中表明SMIC50濃度通常在浮游菌株MIC濃度的3～4倍，相比之下ε-PL對生物膜的抑制作用具有明顯優勢。通過繪制生物膜時間-抑制曲線表明ε-PL對生物膜的抑制作在后12h即可發揮明顯的抑制作用。菌絲是白念珠菌重要的毒力因子，不僅是白念珠菌生物膜的重要組成部分芽，也是其發揮致病作用的物質基礎。本研究中，通過對其芽管形成率、芽管長度、以及酵母-菌絲相轉化等方面的考量，結果表明ε-PL在MIC和MFC濃度下，對白念珠菌的芽管形成率有顯著的抑制作用(P＜0.05)。在液態培養基中，ε-PL白念珠菌的酵母-菌絲轉化也具有明顯抑制作用。

現階段關于ε-PL機制研究中絕大多數研究者認為ε-PL對病原體的抑菌作用主要通過氈毯模型中所描述膜損傷機制導致菌體死亡[12]。本實驗證實ε-PL作用于菌體后，白念珠菌內ROS含量增長，這種現象也出現ε-PL作用于大腸埃希菌中，這與文獻中報道的其他抗真菌劑通過促進ROS的增多來發揮殺菌效果相一致[13-14]。ROS是一類高反應性的小分子，包含有氧衍生自由基等超氧陰離子(O2-)和羥基自由基(OH-)，或非自由基分子，如過氧化氫(H2O2)。本實驗結果表明ε-PL作用白念珠菌后，ROS和MDA含量均隨著ε-PL濃度的增加而增加，在加入抗氧化劑后，MDA含量均出現了顯著下降。推測ε-PL作用于菌體產生的ROS和菌體膜脂質氧化損傷有密切相關。換言之，ε-PL作用于白念珠菌后導致菌體內過量ROS，ROS對菌體的細胞膜脅迫出現丙二醛(MDA)含量的增加。丙二醛可以與白念珠菌內的核酸和蛋白質反應，從而改變他們的結構和生物學特征，Bo等[15]也支持這個觀點。葉若松等[8]在研究ε-PL對大腸埃希菌機制研究中，表明-PL誘導大腸埃希菌ROS升高，以及氧脅迫基因oxyR、sodA等基因表達量上升。Liu等[16]推測ε-PL作用于白念珠菌產生的大量ROS有可能是誘導菌體凋亡的原因，但是具體的分子機制還沒有進行研究。

ε-PL具有較高的水溶性、無毒性、以及穩定性等特點，現階段成熟的生物工程制備模式讓其也具有經濟性的特點。本實驗初步證實了ε-PL對白念珠菌具有良好的抑制作用，同時對菌絲及生物膜等重要毒力因子具有顯著的抑制作用。同時初步證實了ε-PL作用于白念珠菌后增加ROS產生發揮抑菌作用。