耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不同年份分離株耐藥元件基因比較研究

付啟云 鄭紹同 連建春 戴京京 張小云

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，淮安 223300)

多年來，鮑曼不動(dòng)桿菌一直是我國醫(yī)院臨床最常見分離到的菌種之一，該菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性也持續(xù)保持高位。根據(jù)我國全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CARSS)的2014—2016年3年度全國性耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率遠(yuǎn)高于銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥問題已經(jīng)十分嚴(yán)重，國內(nèi)(廣州與杭州)[1-4]與國外[5-8]近年均有極度耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株報(bào)道[2-8]。多年來，國內(nèi)關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥元件基因研究屢有報(bào)道，但尚無在同一家醫(yī)院對(duì)相隔多年的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株進(jìn)行耐藥元件基因檢測(cè)與分析報(bào)道。本文收集了南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院的相隔7年的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株，對(duì)其耐藥元件基因進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告與分析如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與菌種鑒定

耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不同年份分離株收集分離自南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院。分別為2008年20株，2016年20株。本研究中2008年分離株菌株號(hào)為1-20；2016年分離株菌株號(hào)為21-40。菌種鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌種特異mdfA基因與blaOXA-51基因(該基因在不動(dòng)桿菌屬菌中僅鮑曼不動(dòng)桿菌擁有)PCR雙重檢測(cè)為陽性方確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌。

1.2 抗菌藥物藥敏試驗(yàn)

VITEK2-Compact全自動(dòng)分析儀儀器法和K-B紙片法雙重檢測(cè)。

1.3 菌體DNA提取

鮑曼不動(dòng)桿菌菌株DNA提取為蛋白酶K溶液56℃消化法，經(jīng)100℃ 10min滅活蛋白酶K后即用作耐藥元件基因檢測(cè)。

1.4 耐藥元件基因檢測(cè)

耐藥元件基因檢測(cè)為PCR法。檢測(cè)項(xiàng)目見表1，引物序列由無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室提供。PCR擴(kuò)增試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

1.5 菌株親緣關(guān)系分析

耐藥元件基因測(cè)得結(jié)果作UPGMA法樣本聚類分析(由無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室完成)，進(jìn)而了解菌株間的親緣關(guān)系。

表1 耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥元件基因檢測(cè)項(xiàng)目Tab.1 Resistant determinants in drug-resistant Acinetobacter baumannii

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌2008和2016年不同年份分離株藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果及百分率(%)見表2。

2.2 耐藥元件基因結(jié)果

2008和2016年不同年份分離株均檢出blaADC、blaOXA-51，但blaOXA-2群、blaOXA-23群、aac(2')-Ⅰb、aph(3')-Ⅰ、armA、tnpU、tnp513、IS26和ISaba1等9種只有2016年的分離株被測(cè)出。不同年份分離株檢測(cè)結(jié)果及百分率(%)見表3。

2.3 菌株親緣關(guān)系分析

2008和2016年不同年份分離株耐藥元件基因檢測(cè)結(jié)果的樣本聚類分析見圖1。由樹狀圖可見，2008和2016年不同年份分離株成兩個(gè)獨(dú)立的簇群，2016年分離株聚集性更強(qiáng)相差系數(shù)更小(即菌株更接近)。

2.4 耐藥元件基因檢測(cè)結(jié)果陽性模式

耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不同年份分離株耐藥元件檢測(cè)陽性模式及占比百分率見表4。

表2 耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不同年份分離株藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果及百分率Tab.2 Resistant rates of drug-resistant Acinetobacter baumannii to antimicrobial agents isolated from different years

3 討論

盡管鮑曼不動(dòng)桿菌僅為條件致病菌，但由于該菌有極強(qiáng)的生物膜生成能力[8]，因而常常導(dǎo)致住院重癥患者呼吸機(jī)相關(guān)肺炎和導(dǎo)管相關(guān)血行感染，最終導(dǎo)致患者死亡。

國內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥問題嚴(yán)重，近年來，關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥元件基因或全基因組研究國內(nèi)屢有報(bào)道[9-15]，在同一家醫(yī)院對(duì)相隔7年的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株進(jìn)行耐藥元件基因檢測(cè)與分析尚無報(bào)道。

本研究收集相隔7年的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株進(jìn)行耐藥元件基因檢測(cè)，由表2藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果可見，2016年分離株對(duì)第三代頭孢類藥物、碳青霉烯類藥物、氨基糖苷類藥物、喹諾酮藥物均為耐藥，因此屬于泛耐藥菌株。2008年分離株僅對(duì)第三代頭孢類藥物耐藥，而對(duì)碳青霉烯類藥物敏感，對(duì)喹諾酮藥物、氨基糖苷類藥物分別有50.00%和60.00%的敏感性，所以2008年分離株僅為多重耐藥菌株。

表3 耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不同年份分離株耐藥元件基因檢測(cè)結(jié)果及百分率Tab.3 Positive rates of resistance determinants in drug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from different years

圖1 2008年和2016年不同年份分離株耐藥元件基因檢測(cè)結(jié)果的樣本聚類分析Fig.1 Sample cluster analysis of drug resistance element gene detection results of isolates from different years of 2008 and 2016

表4 耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不同年份分離株耐藥元件檢測(cè)陽性模式及百分率Tab.4 Positive modes of resistance determinants in drug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from different years

本文不同年份分離株耐藥元件檢測(cè)顯示(表3)，2008年和2016年分離株均檢出blaADC、blaOXA-51，但blaOXA-2群、blaOXA-23群只有2016年分離株均被檢出。β-內(nèi)酰胺酶基因blaOXA-51其表達(dá)產(chǎn)物無碳青霉烯類藥物水解活性,但鮑曼不動(dòng)桿菌中均存在blaOXA-51基因(位于染色體上)所以被用作菌種鑒定，以區(qū)分于同屬的其它不動(dòng)桿菌。本文2008年分離株對(duì)第三代頭孢類藥物耐藥主要與blaADC相關(guān)，2016年分離株對(duì)第三代頭孢類藥物、碳青霉烯類藥物耐藥主要與blaADC、blaOXA-2群和blaOXA-23群相關(guān)。2016年分離株均測(cè)出aac(2')-Ⅰb、aph(3')-Ⅰ、armA等3種氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因，而2008分離株均無檢出，故2016年分離株對(duì)氨基糖苷類藥物高耐藥性的遺傳背景明確。可移動(dòng)遺傳元件遺傳標(biāo)記tnpU、tnp513、IS26、ISaba1等4種也只有2016年分離株被全部檢出。可移動(dòng)遺傳元件是獲得性耐藥基因的載體，ISaba1可與blaOXA-23連鎖[9]。轉(zhuǎn)座子和插入序列等組成的可移動(dòng)遺傳元件是獲得性耐藥基因快速傳播的原因。

本文的菌株親緣關(guān)系分析，由圖1可見，2008年和2016年不同年份分離株分成兩個(gè)獨(dú)立的簇群(A簇群和B簇群)，2016年分離株聚集性更強(qiáng)，相差系數(shù)更小(即菌株更接近)。A和B簇群均可分為兩個(gè)亞簇群。A-1亞簇群有兩個(gè)克隆播散，A-2、B-1、B2亞簇群各有一個(gè)克隆播散。其中2016年分離株B-簇群一個(gè)有14株菌構(gòu)成的大克隆播散。

本文耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不同年份分離株耐藥元件檢測(cè)陽性模式顯示(表4)，2008年分離株僅攜帶2種～7種耐藥元件基因；2016年分離株則攜帶14～16種耐藥元件基因。不同年份分離株耐藥元件基因攜帶狀況差異明顯。