血流感染肺炎克雷伯菌中CRISPR-Cas系統的分布及其與毒力基因和耐藥的關系

杜芳玲 黃先琪 魏丹丹 梅艷芳 劉盼盼 劉洋,* 萬臘根

(1 南昌大學第一附屬醫院檢驗科，南昌 330006；2 南昌大學公共衛生學院，南昌 330006)

肺炎克雷伯菌是臨床常見的條件致病菌之一，近年來呈現多耐藥、高毒力特點，嚴重危害人類健康。在腸桿菌科中，肺炎克雷伯菌是僅次于大腸埃希菌的血流感染病原菌[1]。由成簇的規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相關序列(CRISPR-associated sequences, Cas)組成的CRISPR-Cas系統是新發現的原核生物獲得性免疫系統，具有調控細菌耐藥和毒力的重要作用[2]，但具體的作用機制不清楚。本研究以血流感染非重復肺炎克雷伯菌248株為研究對象，闡述了血流感染肺炎克雷伯菌中CRISPRCas系統的分布及其與毒力基因和耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及鑒定

收集南昌大學第一附屬醫院2015年1月—2017年12月分離248株血流感染的非重復肺炎克雷伯菌作為實驗菌株，采用Vitek2-Compact全自動細菌鑒定儀進行生化鑒定并保存。

1.2 CRISPR/CAS系統檢測

參考Lin等[3]文獻，PCR擴增檢測cas1、CRISPR1和CRISPR23個基因，引物、體系和條件參照文獻進行。cas1陽性及至少1個CRISPR基因座(CRISPR1或CRISPR2)陽性說明CRISPR-Cas系統存在，定義為CRISPR/Cas+，其余為CRISPR/Cas-。

1.3 莢膜血清分型及毒力基因檢測

熱裂解法提取菌株DNA。對所有肺炎克雷伯菌用PCR方法篩選高毒力莢膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54和K57)[4]，并用PCR方法對其擴增12種常見毒力基因(rmpA,iutA,magA,wcaG,mrkD,,aerobactin,rmpA2,fimH,entB,kfu,ybtS,kpn)，PCR的擴增引物、體系和條件參照相關文獻進行[5-6]。

1.4 藥敏試驗和耐藥基因檢測

體外藥物敏感性試驗用Vitek2-Compact全自動微生物分析儀開展，參照美國臨床實驗室標準化研究所(M100-S27)規定的標準對耐藥(R)、中介(I) 、敏感(S)的解釋。PCR擴增檢測13種耐藥基因，其中4種碳青霉烯酶基因(blaNDM、blaKPC、blaVIM和blaOXA-48)、3種β-內酰胺酶基因(blaSHV、blaCTX-M-14和blaTEM)、2種16S rRNA甲基化酶基因(armA和rmtB)，4種PMQR基因(acc(6')-Ib-cr、qnrA、qnrB和qnrS)，PCR的擴增引物、體系和條件參照文獻[7]進行。

1.5 統計分析

使用SPSS 21統計軟件進行統計分析，根據是否攜帶CRISPR-Cas分為兩組，對其莢膜血清分型、毒力基因、抗菌藥物的耐藥性、耐藥基因、進行比較。由于是計量資料使用χ2檢驗進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRISPR-Cas系統檢測、莢膜血清分型及毒力基因分布

248株血源性肺炎克雷伯菌中，攜帶有CRISPRCas系統菌株共74株，陽性率為 29.8%(74/248)，高毒力莢膜血清型69株，陽性率為27.8 %(69/248)，且主要為K1型(23株，33.3%)、K2型(21株，30.4%)和K54(11株，15.9%)，其余為K5型(1株，1.4%)、K20(4株，5.8%)和K57(9株，13.0%)，其中攜帶CRISPR-Cas與的高毒力血清型肺炎克雷伯菌29株，陽性率為11.7%(29/248)。此外，7種毒力基因中檢出率最 高為fimH(94.8%)，其次為mrkD(92.3 %)(表1)。

2.2 CRISPR-Cas系統與莢膜血清分型、毒力基因的關系

高毒力莢膜血清型菌株在CRISPR-Cas+與CRISPR-Cas-菌株中的陽性率分別為39.2%(29/74)和23.0%(40/174)，兩者比較差異有統計學意義(P＜0.01)，K1型是攜帶CRISPR-Cas系統肺炎克雷伯菌的主要莢膜血清分型，占 28.4%(21/74)。除kpn基因外，攜帶CRISPR-Cas系統菌株的毒力基因的檢出率均大于不攜帶CRISPR-Cas系統菌株，其中7種(rmpA、iutA、magA、wcaG、aerobactin、rmpA2和kfu)差異有統計學意義(P值均小于0.05)(表1)。

表1 CRISPR-CAS、K分型及毒力基因攜帶[n(%)]Tab.1 Detection of CRISPR-CAS, capsular serotypes and virulence genes [n(%)]

2.3 藥敏結果及其與CRISPR-Cas系統的關系

藥敏結果顯示，除對氨芐西林耐藥率達100%外，攜帶有CRISPR-Cas系統菌株對于其他抗菌藥物的耐藥率均小于不攜帶有CRISPR-Cas系統菌株，其中12種(頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林/三唑巴坦、氨曲南、阿米卡星、左氧氟沙星、復方磺胺甲噁唑、厄他培南、亞胺培南、美羅培南)差異有統計學意義(P值均小于 0.05)(表2)。

2.4 耐藥基因分布及其與CRISPR-Cas系統的關系

PCR擴增耐藥基因顯示對于blaNDM、blaKPC、blaTEM、blaCTX-M-14、blaSHV、rmtB、qnrB、qnrS、acc(6')-Ib-cr陽性率，攜帶CRISPR-Cas系統的菌株小于不攜帶CRISPR-Cas系統的菌株，且blaKPC、blaSHV、qnrS差異有統計學意義(P值均小于0.05)(表3)。

表2 抗菌藥物耐藥分布[n(%)]Tab.2 Distribution of antimicrobial drug resistance R[n(%

表3 耐藥基因攜帶[n(%)]Tab.3 Detection of resistance gene[n(%)]

3 討論

CRISPR-Cas系統是細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可對抗噬菌體、質粒等外源性DNA[8]。本研究首次分析了血流感染肺炎克雷伯菌中CRISPR-Cas系統的分布情況，并初步探討了該系統與毒力基因和耐藥的關系。

本研究中CRISPR-Cas系統的檢出率為29.8%(74/248)，比Marth等[9]報道(11.5%)和Lin等[3]報道(12.4%)檢出率高。莢膜血清分型結果表明大部分K1(91.3%)攜帶CRISPR-Cas系統，這與Lam等[10]報道相符：大多數CG23型(n93, 94.9%)肺炎克雷伯菌攜帶CRISPR/Cas系統。

毒力基因檢測結果顯示攜帶CRISPR-Cas系統菌株的毒力基因檢出率均大于不攜帶CRISPR-Cas系統菌株， 其中7種差異有統計學意義，所以攜帶CRISPR-Cas系統的肺炎克雷伯菌毒力基因檢出率更高。CRISPR-Cas系統對存在質粒上的毒力基因iutA、rmpA2等沒有剪輯作用有待進一步研究。然而在志賀菌中活性CRISPR-Cas系統的存在與所檢測毒力基因的分布無關[11]；在肺炎鏈球菌中，含有莢膜基因的質粒的菌株可以通過CRISPR-Cas系統干擾阻斷其質粒進入無毒菌株，從而抑制毒力株的出現[12]。

CRISPR-Cas系統通過Cas蛋白將外源性基因裂解，從而限制基因的水平轉移，抵抗噬菌體感染及質粒接合轉移等[13]。而肺炎克雷伯菌耐藥的主要機制之一是耐藥基因的水平轉移，目前有關CRISPR與耐藥關系的報道在不同的細菌中尚不一致，糞腸球菌中cas1或cas3與多重耐藥的獲得呈負相關[14]；另一研究也發現糞腸球菌的CRISPR-Cas與獲得性耐藥關相反[15]。但王琳琳等[16]發現志賀菌中CRISPR-S4陽性菌株與陰性菌株之間多重耐藥的分布差異無統計學意義；Touchon等[17]發現大腸埃希菌的CRISPER-cas I-E在敏感株和耐藥株間無差異，并且耐藥質粒仍可以在CRISPR陽性大腸埃希菌之間傳播。本研究分析了CRISPR-Cas系統與耐藥的分布，藥敏結果發現除對氨芐西林天然耐藥外，CRISPR-Cas系統與其他抗菌藥物的耐藥率呈負相關，與Lin等[3]報道相符。耐藥基因結果顯示攜帶CRISPR-Cas系統的肺炎克雷伯菌相對于不攜帶CRISPR-Cas系統菌株耐藥基因陽性率低，且KPC、SHV和qnrS差異有統計學意義。

本研究只是初步地探討了肺炎克雷伯菌中CRISPR-Cas系統與毒力基因和耐藥的關系，發現了CRISPR-Cas系統可能能降低耐藥基因在肺炎克雷伯菌中的水平傳播，尤其是在K1型肺炎克雷伯菌，但其對毒力基因沒有剪輯作用還待研究。另外CRISPR-Cas對毒力和耐藥的影響機制也還待進一步研究探討。