產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌ESBLs基因與可移動遺傳元件相關(guān)性分析

莫梢梢 劉寶 胡智成 萬珊 費櫻,,*

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，貴陽 550004；2 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 微生物免疫科，貴陽 550004)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, Kpn)是革蘭陰性腸桿菌科細(xì)菌，可引起下呼吸道、泌尿道及消化道等多部位感染，是臨床分離及院內(nèi)感染最常見的致病菌之一[1]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases, ESBLs)能夠水解幾乎所有β-內(nèi)酰胺酶抗生素，是Kpn出現(xiàn)多重耐藥的重要原因[2]。可移動遺傳元件(mobile genetic elements, MGEs)是ESBLs基因等多種耐藥基因的載體，可通過細(xì)菌接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式捕獲耐藥基因，并整合到自身基因組中，使受體菌出現(xiàn)相應(yīng)的耐藥表型，從而出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，是醫(yī)院感染病原菌常見的耐藥機(jī)制[3]。國內(nèi)外有文獻(xiàn)報道，肺炎克雷伯菌的多重耐藥性與可移動遺傳元件有關(guān)[4-8]。產(chǎn)ESBLs Kpn表現(xiàn)為多重耐藥是否與其可移動遺傳元件的存在有關(guān)，本地區(qū)報道較少。為了了解本地區(qū)產(chǎn)ESBLs Kpn的ESBLs基因及可移動遺傳元件標(biāo)記基因攜帶情況及其相關(guān)性，本研究分別對產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs Kpn中4種ESBLs基因、8種MGEs標(biāo)記基因進(jìn)行檢測分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

產(chǎn)和非產(chǎn)ESBLs Kpn非重復(fù)菌株(鑒定率為95%以上)各100株，來源于2017年7—10月我院的住院患者。

質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853和肺炎克雷伯菌ATCC700603，購自貴州省臨床檢驗中心。

1.2 主要儀器和試劑

MicroScan WalkAway 96 plus全自動細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀(美國Beckman Coulter公司)；ProFlex型PCR儀(美國ABI公司)；GenoSens1500凝膠成像儀(上海Clinx公司)；DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒與高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定、耐藥表型確認(rèn)及藥敏試驗

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(3版)[9]要求進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，采用全自動細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀進(jìn)行菌株鑒定、耐藥表型確認(rèn)及藥敏試驗，并參照美國食品和藥品管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。產(chǎn)ESBLs的Kpn為產(chǎn)ESBLs Kpn，既不產(chǎn)ESBLs、也不是耐碳青霉烯類的Kpn為非產(chǎn)ESBLs Kpn。

1.3.2 DNA提取

采用試劑盒分別進(jìn)行細(xì)菌基因組及質(zhì)粒DNA提取。

1.3.3 目的基因檢測

根據(jù)NCBI中已發(fā)布的目的基因序列設(shè)計合成引物，見表1。在細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)的LB液體培養(yǎng)基中未加細(xì)菌，培養(yǎng)條件及DNA提取過程均同Kpn標(biāo)本，得到的液體則作為陰性對照。采用PCR法檢測目的基因，其反應(yīng)體系為：ddH2O 9.5μL、模板DNA 1μL、10μmol/L的上、下游引物各1μL、PremixTaq酶12.5μL，總體積為25μL，基因的擴(kuò)增條件見表2。基因擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0%瓊脂凝膠中150V電泳30min后于凝膠成像儀下觀察并保存結(jié)果。隨機(jī)抽取每個目的基因PCR陽性產(chǎn)物3株進(jìn)行測序，測序結(jié)果作Blast比對。

1.4 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計軟件使用SPSS 21.0，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因檢測結(jié)果的相關(guān)性研究，采用指標(biāo)聚類分析法。

2 結(jié)果

2.1 目的基因檢測

產(chǎn)ESBLs Kpn中，ESBLs基因陽性率高達(dá)100%，基因型以blaSHV-12、blaTEM-1和blaCTX-M-125為主；MGEs標(biāo)記基因以IS26、ISEcp1、traA、trbC和intI1為主，陽性率均高于非產(chǎn)ESBLs Kpn的陽性率(P＜0.05)。此外，產(chǎn)ESBLs Kpn中，同時檢出ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因的檢出率明顯高于非產(chǎn)ESBLs Kpn的檢出率(P＜0.05)；產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs Kpn中均沒有只檢出MGEs標(biāo)記基因的菌株。產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs Kpn目的基因攜帶情況詳見表3～4，部分基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

2.2 序列比對

基因測序結(jié)果作BLAST比對，相似性均大于95%，見圖2。

2.3 指標(biāo)聚類分析

指標(biāo)聚類分析結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs Kpn中基因blaSHV-12、blaOXA-1與MGEs基因tnpU、tnp513、merA、intI1相關(guān)聯(lián)，基因blaTEM-1、blaCTX-M-125與MGEs基因ISEcp1、IS26、traA相關(guān)聯(lián)，見圖3～4；非產(chǎn)ESBLs Kpn中ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因相關(guān)性不明顯，見圖5～6。

表1 PCR引物序列Tab.1 The primers used in PCR

表2 擴(kuò)增基因的PCR反應(yīng)條件Tab.2 PCR reaction condition of DNA amplification

表3 產(chǎn)ESBLs Kpn與非產(chǎn)ESBLs Kpn目的基因檢測陽性率(%)Tab.3 Positive rate of target genes in ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae and non-ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae (%)

表4 產(chǎn)ESBLs Kpn與非產(chǎn)ESBLs Kpn目的基因的檢出率Tab.4 Detection rate of target genes in ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae and non-ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae

3 討論

圖1 blaSHV-12基因PCR電泳圖Fig.1 The PCR electrophoretogram of blaSHV-12 gene

圖2 blaSHV-12基因測序結(jié)果比對圖Fig.2 The comparison chart of sequencing results of blaSHV-12 gene

ESBLs是由質(zhì)粒編碼的β-內(nèi)酰胺酶，能夠水解青霉素、氨曲南及第一、二、三代頭孢菌素等抗生素，從而使Kpn出現(xiàn)多重耐藥。本研究中，產(chǎn)ESBLs Kpn ESBLs基因陽性率高達(dá)100%，基因型以blaSHV-12、blaTEM-1和blaCTX-M-125為主，提示我院產(chǎn)ESBLs Kpn ESBLs基因攜帶率高，以blaSHV、blaTEM和blaCTX-M型產(chǎn)ESBLs Kpn多見，與汪琴琴等[10-12]學(xué)者報道一致。

接合性質(zhì)粒主要有traA基因和trbC基因兩個遺傳標(biāo)記，它們分別編碼細(xì)菌性菌毛，是細(xì)菌接合必備的部件。轉(zhuǎn)座子和插入序列屬于轉(zhuǎn)座因子，是一類在細(xì)菌染色體、質(zhì)粒或噬菌體之間自行移動并具有轉(zhuǎn)位特性的DNA，可以使遺傳物質(zhì)優(yōu)化組合，積累有意義的遺傳信息，使細(xì)菌獲得一種新的適應(yīng)能力。整合子則位于細(xì)菌的質(zhì)粒或染色體上，具有位點特異性重組功能，能捕獲及整合外源耐藥基因，從而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生和播散。這3類MGEs能捕獲多種外源性耐藥基因，與細(xì)菌多重耐藥相關(guān)。有文獻(xiàn)報道，Kpn中MGEs的常見標(biāo)記基因有traA、trbC、merA、tnpU、tnp513、ISEcp1、IS26和intI1基因[13-17]。為此，本研究探討了產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs Kpn中這8類MGEs標(biāo)記基因與常見的ESBLs基因攜帶情況。結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs Kpn攜帶的MGEs標(biāo)記基因以IS26、ISEcp1、traA、trbC和intI1基因為主，陽性率均明顯比非產(chǎn)ESBLs Kpn的高；同時檢出ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因的檢出率明顯高于非產(chǎn)ESBLs Kpn的檢出率，提示產(chǎn)ESBLs Kpn ESBLs基因攜帶率高、出現(xiàn)多重耐藥，可能與MGEs的攜帶率高、獲得多種外源性耐藥基因可能性大有關(guān)。此外，產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs Kpn中均沒有只檢出MGEs標(biāo)記基因的菌株，提示MGEs標(biāo)記基因在Kpn中可能不是單獨存在的。為進(jìn)一步了解產(chǎn)ESBLs Kpn攜帶的ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因的相關(guān)性，本研究對產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs Kpn目的基因檢測結(jié)果分別作了指標(biāo)聚類分析，結(jié)果提示，產(chǎn)ESBLs Kpn中基因blaSHV-12、blaOXA-1與MGEs標(biāo)記基因tnpU、tnp513、merA、intI1相關(guān)聯(lián)，基因blaTEM-1、blaCTX-M-125與MGEs標(biāo)記基因ISEcp1、IS26、traA相關(guān)聯(lián)；非產(chǎn)ESBLs Kpn中ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因相關(guān)性不明顯，提示產(chǎn)ESBLs Kpn攜帶的ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因存在相關(guān)性，可能是產(chǎn)ESBLs Kpn出現(xiàn)多重耐藥的重要原因，與文獻(xiàn)報道一致[18-21]。

圖3 產(chǎn)ESBLs Kpn ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因檢測結(jié)果的指標(biāo)聚類分析(基因組)Fig.3 The index cluster analysis for the detection results of ESBLs genes and genetic markers of MGEs in ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae (Genome)

圖4 產(chǎn) ESBLs Kpn ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因檢測結(jié)果的指標(biāo)聚類分析(質(zhì)粒)Fig.4 The index cluster analysis for the detection results of ESBLs genes and genetic markers of MGEs in ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae (Plasmid)

圖5 非產(chǎn) ESBLs Kpn ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因檢測結(jié)果的指標(biāo)聚類分析(基因組)Fig.5 The index cluster analysis for the detection results of ESBLs genes and genetic markers of MGEs in non-ESBLsproducing Klebsiella pneumoniae (Genome)

圖6 非產(chǎn) ESBLs Kpn ESBLs基因與MGEs標(biāo)記基因檢測結(jié)果的指標(biāo)聚類分析(質(zhì)粒)Fig.6 The index cluster analysis for the detection results of ESBLs genes and genetic markers of MGEs in non-ESBLsproducing Klebsiella pneumoniae (Plasmid)

綜上所述， 產(chǎn)ESBLs Kpn ESBLs基因和MGEs標(biāo)記基因攜帶率高，兩者存在相關(guān)性，可能是產(chǎn)ESBLs Kpn出現(xiàn)多重耐藥的重要原因；MGEs標(biāo)記基因在Kpn中可能不是單獨存在的。