PPtase高表達菌株Streptomyces ghanaensis的發酵及其產物cytoxazone的發現

黃曉偉 閆曉麗 田文雅 瞿旭東

(1 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，武漢 430030；2 武漢大學藥學院，武漢 430072)

天然產物對新藥的發現和發展至關重要。過去30年間，國際上被批準的小分子藥物中有50%以上來源于天然產物及其衍生物，抗腫瘤和抗感染(抗細菌、真菌、寄生蟲和病毒)的比率更是高達79.8%和69.8%[1]。然而由于長期缺乏新的研究方法和研究思路，新結構的活性天然產物發現率愈來愈低；加之新的代謝性疾病及多重耐藥菌的發展快于新活性化合物的臨床應用，醫藥領域對新的活性天然產物愈發迫切的需求，已成為當前藥物研發領域最需解決的瓶頸之一[2]。另外，從天然產物中發現新的活性化合物的方式也是化學合成所不能替代的[3-4]。因此，從天然產物中尋找具有新穎結構和顯著活性的化合物，仍將是更快捷、更有效的方式。

基因組學研究表明，目前已鑒定的微生物天然產物大約只占微生物生產能力的10%，大量的天然產物由于在實驗室條件下處于“沉默”狀態或微量表達而有待發掘[5-6]。隨著對天然產物生物合成機制了解的日漸深入，發現天然產物的“沉默”狀態或微量表達主要是由于在其生物合成基因的表觀遺傳、轉錄、翻譯以及蛋白后修飾環節的調控問題導致的[7]。基于這些環節，近年來國際上發展了一系列有效的方法，在激活“沉默”天然產物生物合成基因簇("silent" or "cryptic" gene cluster)中取得了巨大成功[8]。其中，本研究發現了微生物體內磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶(phosphopan-tetheinyl transferases,PPTase)過強或過弱的修飾次級代謝和初級代謝載體蛋白(carrier protein, CP)是導致天然產物沉默的重要因素[9]。通過向33株放線菌中過量表達來自枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)和黃萎病鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的PPtase基因sfp和svp，共有23株菌株(70%)產生了一系列原先“沉默”的天然產物。對其中的一些菌株的激活產物的分離鑒定，我們發掘到了包括II型聚酮(type II polyketide) oviedomycin、I型聚酮(type I polyketide)化合物halichomycin和defumarylhygrolidin以及核苷類化合物puromycin等一系列沉默的天然產物[9-10]。為了進一步發掘和鑒定未知激活的天然產物，本研究中，我們對前期獲得的一株鏈霉菌重組菌株Streptomyces ghanaensisCGMCC 4.1967-PPtase中的一個未知激活組分的分離，通過核磁鑒定發現了其為一種高效的細胞因子抑制劑cytoxazone。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

儀器：LC-20AT型島津高效液相色譜(HPLC，Shimadzu公司)，C18分析柱(Agilent Eclipse XDB-C18，5μm，4.6mm×250mm，美國Agilent公司)；核磁儀(Bruker BioSpin GmbH，400MHz德國Bruker公司)；ZWY-2102C型搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)，SPX-70BIII生化培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。試劑：均為分析純試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 培養基和化學試劑

TSB(100mL)：3.0g 胰蛋白胨大豆肉(Tryptone Soya Broth, TSB)，去離子水定容至100mL。MS(100mL)：2.0g 甘露醇(Mannitol)，2.0g 黃豆粉(Soy Flour)，自來水定容至100mL。阿泊拉霉素(Apramycin，購自Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵及HPLC檢測條件

從-30℃低溫保存冰箱中取出保種用的甘油管，在無菌操作臺中，取出20μLS.ghanaensisCGMCC 4.1967-PPTase菌液[9]接種于含有相應濃度的阿泊拉霉素抗生素的4mL TSB培養基中，于30℃、220r/min搖床培養至一定濃度，然后吸取200μL菌液轉接入250mL MS液體培養基中(共9L)，置于28℃，220r/min搖床中，發酵培養7d后取出。將等體積的乙酸乙酯加入發酵培養基中，超聲萃取15min，充分靜置分層后，取出乙酸乙酯層，反復萃取3次，旋轉濃縮得發酵浸膏9.5g。稱取少量浸膏，用甲醇溶解，溶液用0.22μm的有機相微孔濾膜過濾，用于HPLC檢測，檢測條件：分析條件為T=0min，5%B；T=50min，100%B；T=50.01min，5%B；T=60min，5%B。其中A相：超純水；B相：乙腈；流速為1mL/min；檢測波長為254nm；柱型號：Agilent Eclipse XDB-C18。

2 結果與討論

2.1 分析S.ghanaensis CGMCC 4.1967-PPTase發酵液組分

前期的研究過程中我們獲得了一株sfp和svp過表達的菌株S.ghanaensisCGMCC 4.1967-PPTase，該菌株相對于野生型菌株S.ghanaensisCGMCC 4.1967能夠激活產生聚酮化合物halichomycin和defumarylhygrolidin[9]。進一步對比其與野生菌株的發酵液組分，我們發現在檢測波長為254nm的條件下，保留時間為16.8min (HPLC)處還產生了一個顯著增強的峰(圖1)。盡管在野生型菌株發酵液相應的保留時間處也存在著一個峰，但是兩者之間的紫外吸收明顯不同，屬于不同化合物。

圖1 HPLC分析S.ghanaensis CGMCC 4.1967野生菌株和PPTase重組菌株的發酵液組分Fig.1 HPLC analysis of metabolites production in S.ghanaensis CGMCC 4.1967 wild-type and PPTase strains

2.2 分離鑒定激活產物

為了鑒定該激活產物，我們對發酵并萃取得到的9.5g浸膏與甲醇混溶后硅膠拌樣，以石油醚(PE):乙酸乙酯(EA)，乙酸乙酯:丙酮作為流動相，以硅膠作為固定相，TLC為檢測手段，按0:100～100:0的梯度進行洗脫，分離得9個組分(編號為S1～S9)；其中，目標化合物主要集中于S9(石油醚:乙酸乙酯=90:10)，分離流程見圖2。目標化合物在S9組分靜置過程中以白色無定型白色粉末形態析出，過濾分離以及反復溶解析出后可以得到純凈的化合物30mg。

2.3 化合物的結構鑒定

高分辨質譜分析確定該化合物正離子分子量為[M+H]+m/z224.0920，可以推出分子式為C11H13NO4。由1H (400MHz, CD3OD)(圖3A)，δH7.22(d,J=8.4Hz, 2H)，δH6.96 (d,J=8.4Hz, 2H)。可知，該化合物含有一個1,4-雙取代的苯環結構，這一點通過13C (101MHz, CD3OD)(圖3B)δC127.8，δC113.6的高度是其他碳譜的2倍得以證實。由δH3.82 (s, 3H)，δC54.4，δC159.9說明對位取代的基團是OMe。δC160.7說明含有一個羰基。由δC57.2，61.5，81.3可知這3個碳原子與雜原子相連，由δH5.00(d,J=8.4Hz, 1H)可知與該氫相連的碳原子與苯環相連(受苯環電子屏蔽效應，化學位移向低場位移)，且鄰位碳上含有一個氫原子，根據1H譜，該氫應是δH4.88(m, 1H)，所連碳原子為手性碳原子，則另外兩個氫原子δH3.20(m, 2H)所在的碳原子與其毗鄰，通過與文獻對比[11]，確定該化合物為cytoxazone。

圖2 Cytoxazone的分離純化流程Fig.2 Purification process of cytoxazone

Cytoxazone能夠選擇性抑制Th2細胞(對Th1細胞無效)產生Ⅱ型細胞因子，因此具有很好的應用前景，可以用于治療一系列細胞因子失調的疾病，如風濕免疫系統疾病，惡性淋巴瘤等[12]。此前，該化合物僅報道由一株分離自廣島的鏈霉菌(Streptomycessp.)產生[11]，S.ghanaensisCGMCC 4.1967中為首次分離得到。

圖3 Cytoxazone核磁譜圖Fig.3 NMR spectra of cytoxazone

3 結論

本研究通過對一株過表達了PPtase基因的重組菌株S.ghanaensisCGMCC 4.1967的發酵產物進行分析，發現了一個新的激活產物。通過擴大培養，分離純化和核磁鑒定，確定了該化合物為cytoxazone。該化合物是從嘎納鏈霉菌S.ghanaensisCGMCC 4.1967首次分離得到，為后續研究其生物合成機制，合成生物學改造，以及開發新結構活性細胞因子抑制劑提供了堅實的基礎。