基于超臨界流體強化溶液快速分散技術(shù)的冬凌草甲素脂質(zhì)體口服制劑制備工藝研究Δ

吳宏華，吳媛，張繪芳

（1.衢州市人民醫(yī)院藥學部，浙江衢州324000；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 200011）

冬凌草甲素（OridoninA，ORI）屬于貝殼杉烯二萜類化合物，為唇形科香茶菜屬植物冬凌草的主要抗癌活性成分，其對多種移植性腫瘤均有效，在臨床上主要用于原發(fā)性肝癌、食管癌、胰腺癌等的治療，且大劑量應用未發(fā)現(xiàn)骨髓抑制、肝腎功能受損等不良反應，較為安全、有效[1-3］。但ORI的水溶性、脂溶性均較差，導致其口服吸收差，影響了臨床治療效果。為此，國內(nèi)外研究者將其制備成固體分散體、自微乳以及脂質(zhì)體等劑型以解決上述問題[4-6］。

脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇構(gòu)成的磷脂雙分子層閉合形成的小室狀結(jié)構(gòu)，具有與生物膜非常相似的性質(zhì)，因此生物相容性良好；其可提高難溶性藥物的溶解度，具有毒副作用小、易于靶向修飾、易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點[7］。目前，脂質(zhì)體制備方法繁多，常規(guī)方法包括薄膜分散法[8］、逆向蒸發(fā)法[9］、溶劑注入法[10］和噴霧干燥法[11］。但這些技術(shù)普遍存在某些缺陷，如微粒粒徑和分布難以控制、產(chǎn)物得率較低、包封率和載藥量不理想、有機溶劑殘留量大、工藝條件影響藥物活性等[12-13］。超臨界流體強化溶液快速分散技術(shù)（SEDS）作為一種新型微粒制備方法，可以克服上述問題。該技術(shù)操作條件溫和，所得產(chǎn)物顆粒細微，顆粒大小分布均勻，包封率高，載藥量大，且無溶劑殘留，在制劑領(lǐng)域應用日益廣泛[14］。目前，ORI的脂質(zhì)體制劑給藥方式主要為注射給藥，考慮到口服脂質(zhì)體具有作用時間長、刺激性小以及患者依從性好等優(yōu)點[15］，因此本課題組采用SEDS技術(shù)制備ORI的脂質(zhì)體口服制劑（ORI-LIP），并通過正交試驗對制備工藝進行優(yōu)化；同時，與常規(guī)脂質(zhì)體制備方法進行比較，比較不同制備方法所得ORI-LIP的粒徑、包封率、載藥量、穩(wěn)定性及體外溶出行為，為超臨界流體技術(shù)在改善中藥難溶性組分溶解度方面的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BP211D型微量電子分析天平（德國Sartorius公司）；1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；SFE121-50-01型超臨界CO2制粒裝置（南通華興石油儀器有限公司）；R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；Nano ZS90 Zetasizer型粒徑測定儀（英國Malvern公司）；RC-806型溶出度儀（天津因賽科技發(fā)展有限公司）；超濾離心管（美國Millipore公司，截留分子量:10 kDa）；5804R型臺式離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

ORI原料藥（江西本草天工科技有限公司，批號:28957-04-2，純度:≥98%）；大豆卵磷脂（大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度:≥90%）；膽固醇（德國Lipoid公司，純度:≥98%）；CO2（上海交通大學設備科，純度:≥99.999%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 ORI質(zhì)量濃度測定方法

采用高效液相色譜法（HPLC）測定ORI質(zhì)量濃度。

2.1.1 色譜條件色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:甲醇-水（60∶40，V/V）；檢測波長:238 nm；流速:1 mL/min；柱溫:25℃；進樣量:20 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取ORI原料藥適量，以甲醇配制成質(zhì)量濃度為12、30、60、90、150 μg/mL的系列溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以待測物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程:y＝18.034x－0.201 6（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，ORI檢測質(zhì)量濃度在12～150 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。另外，參照2015版《中國藥典》（四部）[16］進行專屬性、精密度、回收率、穩(wěn)定性等項目考察，結(jié)果均符合相關(guān)要求，表明該方法適用于ORI的定量分析。

2.2 ORI-LIP的制備工藝優(yōu)化

2.2.1 工藝流程 參照文獻[17］，采用SEDS技術(shù)制備脂質(zhì)體。首先打開閥A，讓可視沉淀釜的溫度和壓力達到設定值，通過閥C調(diào)節(jié)壓力直至體系達到平衡。精密稱取ORI原料藥1.8 mg、大豆卵磷脂15 mg、膽固醇3 mg，加至乙醇20 mL中溶解完全，打開閥B，將上述溶液通過高壓恒流泵以一定速率由噴嘴輸入到經(jīng)過預穩(wěn)定的沉淀釜內(nèi)。溶液在超臨界CO2中快速擴散，并在短時間內(nèi)達到過飽和狀態(tài)而沉淀到釜底形成微粒。待溶液輸入完畢后，立即關(guān)閉恒流泵和閥B，繼續(xù)通入CO2淋洗、干燥一段時間，以除盡釜內(nèi)的剩余溶劑。關(guān)閉CO2輸入閥A，打開排氣閥C，排出沉淀釜內(nèi)的氣體，待釜內(nèi)壓力降至0 MPa時，打開沉淀釜并收集沉淀物，得到脂質(zhì)體前體。將脂質(zhì)體前體進行水化即可得到ORI-LIP混懸液。SEDS技術(shù)制備流程詳見圖1。

圖1 SEDS技術(shù)制備流程圖Fig 1 Schematic diagram of the apparatus used for SEDS

2.2.2 正交試驗優(yōu)化工藝條件 根據(jù)前期單因素預試驗結(jié)果，針對可能影響制備結(jié)果的3個因素（溫度、壓力、進樣流速），以粒徑為評價指標，選擇L9（34）正交表進行試驗設計，以篩選最佳工藝參數(shù)。因素與水平見表1，正交試驗設計與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗設計與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

由表2可以看出，以上3個因素的極差值都較大，說明三者對粒徑都有較大影響。按極差值大小排序可知，進樣流速對脂質(zhì)體粒徑影響最大，其次為壓力，反應溫度的影響最小。據(jù)此可得最優(yōu)工藝參數(shù)為:溫度50℃，壓力18 MPa，進樣流速1.0 mL/min。

2.2.3 驗證試驗 按“2.2.2”項下確定的最優(yōu)工藝參數(shù)制備ORI-LIP，平行操作3次。結(jié)果顯示，3次制備所得樣品的平均粒徑分別為149.9、150.5、141.9 nm（RSD＜5%），表明該優(yōu)化工藝穩(wěn)定、可行。

2.3 SEDS技術(shù)與常規(guī)制備方法的比較

2.3.1 薄膜分散法（TFD）制備脂質(zhì)體 分別稱取ORI原料藥1.8 mg、大豆卵磷脂15 mg、膽固醇3 mg，加入乙醇20 mL中溶解完全后，轉(zhuǎn)移至100 mL圓底燒瓶中，于50℃減壓旋蒸30 min除去溶劑，然后置于真空干燥箱內(nèi)，于50℃下干燥過夜。取出圓底燒瓶，加水20 mL，于50℃下對底部干燥物進行水化，即得ORI-LIP-TFD混懸液。

2.3.2 逆向蒸發(fā)法（RPE）制備脂質(zhì)體 分別稱取大豆卵磷脂15 mg、膽固醇3 mg，加入乙醇20 mL中溶解完全后，轉(zhuǎn)移至100 mL圓底燒瓶中。將ORI原料藥1.8 mg溶解于適量的水中作為水相，逐滴滴入圓底燒瓶中，30 ℃水浴超聲（功率：100 w，頻率：40 kHz）5 min，然后于50℃減壓旋蒸除去有機溶劑，即得ORI-LIP-RPE混懸液。

2.3.3 不同方法所制備脂質(zhì)體的粒徑與多分散系數(shù)（PDI）比較 將采用TFD、RPE、SEDS方法制備的ORILIP分別用適量水稀釋，采用粒徑測定儀檢測其粒徑及PDI，試驗重復3次。結(jié)果顯示，ORI-LIP-SEDS的粒徑和PDI均低于ORI-LIP-TFD和ORI-LIP-RPE，提示該體系具有更好的穩(wěn)定性，詳見表3。

表3 3種脂質(zhì)體的粒徑和PDI（x±s，n＝3）Tab 3 Particle size and PDI of 3 kinds of liposomes（x±s，n＝3）

2.3.4 不同方法所制備脂質(zhì)體的包封率和載藥量的比較 采用超濾法測定。將采用TFD、RPE、SEDS方法制備的ORI-LIP分別加入適量甲醇破乳，超聲（功率:100 w，頻率:40 kHz）10 min，采用“2.1”項下HPLC法測定ORI的質(zhì)量濃度。另取上述3種ORI-LIP于超濾離心管中，5 000 r/min離心10 min，濾過，取濾液，同法測定ORI的質(zhì)量濃度。按以下公式計算包封率:包封率%＝（W總－W游離）/W總×100%（式中，W游離為超濾離心后濾液中的藥量，W總為破乳后的總藥量）。按以下公式計算載藥量:載藥量（%）＝（W總－W游離）/W脂質(zhì)×100%（式中，W游離為超濾離心后濾液中的藥量，W總為破乳后的總藥量，W脂質(zhì)為脂質(zhì)總量）。結(jié)果顯示，ORI-LIP-SEDS的包封率和載藥量分別達到67.8%和7.8%，均明顯高于ORI-LIP-TFD和ORI-LIP-RPE。3種脂質(zhì)體的包封率和載藥量見圖2。

圖2 3種脂質(zhì)體的包封率和載藥量Fig 2 Encapsulation efficiency and drug-loading amount of 3 kinds of liposomes

2.3.5 不同方法所制備脂質(zhì)體的穩(wěn)定性比較 以脂質(zhì)體的粒徑和包封率變化來考察其穩(wěn)定性。將采用TFD、RPE、SEDS方法制備的ORI-LIP分別置于溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%的條件下進行加速試驗。每個月分別取樣考察，連續(xù)考察6個月，比較存放前后脂質(zhì)體的粒徑和包封率。結(jié)果顯示，在6個月貯存期間，ORILIP-TFD和ORI-LIP-RPE的粒徑均顯著增大，分別由0月時的182.4、175.1 nm增至208.6、192.9 nm，而ORI-LIPSEDS的粒徑僅略有增加；ORI-LIP-TFD和ORI-LIPRPE的包封率均明顯降低，比0月時分別降低了14.8%、13.6%，而ORI-LIP-SEDS僅降低了4.4%，詳見圖3。

圖3 加速試驗期間3種脂質(zhì)體的粒徑和包封率變化Fig 3 Changes of particle size and encapsulation efficiency of 3 kinds of liposomes in accelerated test

2.3.6 不同方法所制備脂質(zhì)體的體外溶出度比較 將ORI原料藥和采用TFD、RPE、SEDS方法制備的ORILIP置于預處理過的透析袋內(nèi)，透析袋兩端扎緊，固定在攪拌漿上，浸沒在溶出介質(zhì)（含0.3%十二烷基硫酸鈉的pH為6.8的磷酸鹽緩沖溶液）100 mL中，設置轉(zhuǎn)速為100 r/min、溫度為37 ℃，分別于10、30 min及1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48 h時取樣1 mL（同時補充等體積空白溶出介質(zhì)）。樣品液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過后，采用“2.1”項下HPLC法測定ORI的質(zhì)量濃度。按公式計算累積溶出度:累積溶出度（%）＝[cn×V2+（c1+c2+…+cn－1）］/L×100%，式中，c1…cn為各時間點所測ORI濃度，V1為取樣體積，V2為溶出介質(zhì)體積，L為制劑標示量。結(jié)果顯示，ORI原料藥的溶出速率要高于各脂質(zhì)體，在1 h內(nèi)就達到了溶出平衡，而各脂質(zhì)體均在12 h后才達到溶出平衡；ORI-LIP-SEDS的溶出速度要慢于ORI-LIP-TFD和ORI-LIP-RPE。同時，各脂質(zhì)體達溶出平衡時的累積溶出度均明顯高于原料藥，其中原料藥為40.6%，而各脂質(zhì)體都高于50%；ORI-LIP-SEDS在24 h時達到溶出平衡，其累積溶出度最高，達到67.2%，詳見圖4。

圖4 ORI原料藥和3種脂質(zhì)體的體外溶出曲線Fig 4 in vitro dissolution curves of ORI raw material and 3 kinds of liposomes

3 討論

脂質(zhì)體由于其類脂雙分子結(jié)構(gòu)在胃腸道可與胃黏膜細胞發(fā)生融合、胞飲和吞噬作用，使藥物口服后易進入胃腸道黏膜而被吸收。而粒徑較小的脂質(zhì)體易于黏附在腸壁上，增加了藥物與腸壁的接觸時間和接觸面積，有利于藥物吸收[18］。藥物的粒徑越小，其溶出度越高，且藥物的釋放和溶出是被機體吸收和利用的前提[19］。本研究選擇采用SEDS技術(shù)作為制備方法以降低ORI脂質(zhì)體的粒徑并提高藥物溶出度，達到改善ORI口服吸收的目的。

在SEDS技術(shù)制備過程中，脂質(zhì)體的粒徑主要受以下幾個因素的影響:（1）溫度。隨著溫度升高，CO2密度減小，CO2對溶劑的傳質(zhì)效率隨之降低，導致顆粒粒徑增大；與此同時，溶質(zhì)分子動能增加，分子之間碰撞概率增加，也可導致顆粒粒徑增大、沉淀率升高[20］。（2）壓力。隨著壓力升高，CO2在溶液中的擴散速度加快，液滴膨脹速率隨之增大，加之溶劑對溶質(zhì)溶解能力降低，從而使成核速率增大，沉淀出的溶質(zhì)微粒比表面積增大，形成的晶核數(shù)量增加，因此沉淀出更多、更細小的溶質(zhì)微粒[21-22］。（3）進樣流速。在進樣流速較低的情況下，流速增加導致CO2與溶液摩爾比減小，進而導致體系膨脹速率減小，從而形成更大的顆粒，沉淀率也減小；而隨著流速的進一步增大，溶液“霧化效應”起到了主導作用，所以形成的顆粒粒徑減小[23-26］；但隨著流速繼續(xù)增加，“霧化效應”降低，顆粒粒徑隨之增大。

本研究結(jié)果顯示，對比常規(guī)制備技術(shù)（TFD、RPE），SEDS技術(shù)制備的脂質(zhì)體具有更高的包封率和載藥量，這可能與該技術(shù)制備的脂質(zhì)體具有更為圓整的形態(tài)、包封能力更強、藥物不易泄漏有關(guān)[27］。此外，ORI-LIP-SEDS在6個月的加速試驗期內(nèi)也表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，這是由于ORI-LIP-SEDS的溶劑殘留量較小，脂質(zhì)體不易被破壞；同時，其良好的包封效果也有利于提高制劑穩(wěn)定性[28］。體外溶出試驗結(jié)果顯示，各脂質(zhì)體中ORI的釋藥速率要低于ORI原料藥，這是由于藥物要通過磷脂雙分子層才得以釋放所致[29］。其中，ORI-LIP-TFD和ORI-LIPRPE溶出速度要快于ORI-LIP-SEDS，這可能是由于前兩者表面有較多吸附藥物的存在，更易擴散至透析袋外所致[30］，而ORI-LIP-SEDS因其良好的包封能力和穩(wěn)定性而表現(xiàn)出更加持久和緩慢的釋放。此外，ORI-LIP-SEDS的累積溶出度高于其他兩種脂質(zhì)體，這可能是因為其粒徑更小，具有更大的比表面積，有利于藥物溶出所致[31］。

綜上所述，本研究通過SEDS技術(shù)制備了粒徑小、包封率和載藥量較高、穩(wěn)定性較好的脂質(zhì)體口服制劑，有效改善了ORI的體外溶出性能。但ORI-LIP作為口服制劑，其體外溶出性能的提高并不能說明其口服后體內(nèi)吸收也必然可得到提升，因此其在體藥動學特征還有待進一步研究。