氣相色譜法同時測定尼爾雌醇原料藥中7種有機溶劑的殘留量Δ

孫 婷，張 菁，姜建國，劉紅莉

（河北省藥品檢驗研究院，石家莊 050011）

尼爾雌醇（Nilethylenol）是一種人工合成的非甾體類雌激素，是雌二醇與雌酮的代謝物。該藥的藥理作用與雌二醇相似，可在體內代謝為炔雌三醇和雌三醇，以原型、炔雌三醇和雌三醇3種形式由尿液排出。有研究指出，在尼爾雌醇第3位碳原子上引入環戊醚后，可增加其親脂性，有利于腸道吸收并儲存在脂肪組織中而發揮長效作用；第17位碳原子上引入乙炔基后，可保護羥基并增強雌激素活性，但對子宮內膜的增生作用較弱，可適用于圍絕經期婦女的雌激素替代治療[1-3］。尼爾雌醇在合成工藝中使用了甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯等有機溶劑，為確保藥品有效、安全以及質量可控，該藥按照2015年版《中國藥典》（四部）[4］、《藥品注冊的國際技術要求:質量部分》[5］及其他相關要求[6］，應增加對該藥有機溶劑殘留量的考察。目前，僅有2015年版《中國藥典》（二部）收載了尼爾雌醇原料藥和片劑的相關標準[7］，而《英國藥典》（2017年版）、《歐洲藥典》（9.0版）、《日本藥典》（17版）、《美國藥典》（41版）均未收載，也尚未見有關測定尼爾雌醇原料藥中有機溶劑殘留量的報道。為此，本研究采用氣相色譜法（GC）同時測定了尼爾雌醇原料藥中甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯7種有機溶劑的殘留量，旨在為其質量標準的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890B型GC儀，包括氫火焰離子化檢測器、柱溫箱（美國Agilent公司）；MCM36型百萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；XS205型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；UL TRASONIC型超聲波清洗機（北京中晟銘科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

尼爾雌醇原料藥（A公司，批號:20170201A，純度:99.8%；B公司，批號:20170202B，純度:99.6%；C公司，批號:20170203C，純度:99.5%）；甲醇對照品（批號:10945607812，純度:≥99.9%）、異丙醇對照品（批號:k47208640544，純度:≥99.9%）、乙腈對照品（批號:JA070530，純度:≥99.9%）均由美國Merck公司提供；乙醇對照品（批號:20180524，純度:≥95.0%）、甲苯對照品（批號:20171114，純度:≥99.5%）、乙酸乙酯對照品（批號:20170824，純度:≥99.5%）均由國藥集團化學試劑有限公司提供；四氫呋喃對照品[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號:H1602108，純度:≥99.9%］；甲醇、異丙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法及結果

2.1 色譜條件

色譜柱:DB-WAX毛細管柱（30 m×0.53 mm，1.00 μm）；檢測器:氫火焰離子化檢測器；分流比:5∶1；載氣:氮氣（純度:99.999%）；流速:1.0 mL/min；進樣量:1 μL，直接進樣；固定相:鍵合交聯聚乙二醇；升溫程序:初始溫度40℃，保持5 min，以10℃/min速率升溫至90℃，再以5℃/min速率升溫至200℃；進樣口溫度：220℃；檢測器溫度：230℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品貯備液 精密量取甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯對照品適量，分別置于100 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，得單一對照品溶液；分別取上述單一對照品溶液適量至同一量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋并定容，制成甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯質量濃度分別為60、100、8.2、100、17.8、14.4、100 μg/mL的混合對照品貯備液。

2.2.2 混合對照品溶液 精密量取“2.2.1”項下混合對照品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取原料藥樣品20 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，即得。

2.2.4 空白對照溶液 以N，N-二甲基甲酰胺為空白對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能實現基線分離，分離度均大于1.5，空白對照溶液對待測物的測定無干擾。

圖1 氣相色譜圖Fig 1 GC chromatograms

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，得系列單一線性關系工作溶液。取上述系列線性關系工作溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equation and linear range

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比為10∶1、3∶1計算定量限、檢測限。結果，甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯的定量限分別為0.24、0.40、0.033、0.40、0.071、0.058、0.40 μg/mL，檢測限分別為0.08、0.10、0.01、0.13、0.02、0.02、0.13 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯峰面積的RSD分別為0.5%、0.2%、0.4%、0.6%、0.3%、0.8%、0.7%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.3”項下供試品溶液（批號:20170201A）適量，分別于室溫放置0、1、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯峰面積的RSD分別為1.4%、1.5%、1.3%、1.8%、1.1%、1.2%、1.7%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置12 h內基本穩定。

2.8 重復性試驗

取原料藥樣品（批號:20170201A）適量，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算樣品中有機溶劑的殘留量。結果，甲醇、乙醇平均殘留量分別為0.01%、0.03%，峰面積的RSD分別為0.7%、0.9%（n＝6），其他成分未檢出，表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號:20170201A），共9份，每份約20 mg，分別加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

續表2Continued tab 2

2.10 樣品中有機溶劑殘留量測定

取3批原料藥樣品各適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并以外標法計算樣品中有機溶劑的殘留量，結果見表3。

表3 樣品中有機溶劑殘留量的測定結果（n＝3，%%）Tab 3 Determination results of residual solvents in samples（n＝3，%%）

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

筆者比較了HP-5（弱極性）、DB-624（中等極性）、HP-210（中等極性）、AT-1000（極性）、DB-Wax（極性）等不同極性毛細管柱的分離效果，結果顯示以DB-Wax極性毛細管柱進行分離時的分離效果最好，峰形尖銳且對稱，靈敏度較高，故選擇DB-Wax極性毛細管柱為本研究的色譜柱。

3.2 溶劑的選擇

尼爾雌醇原料藥在水中幾乎不溶，以水為溶劑時某些殘留有機溶劑亦不溶于水，且可能會包裹在未溶解的固態尼爾雌醇樣品中，而導致進樣濃度不準確，故不宜以水作為溶劑。有研究認為，當樣品不溶于水時，可選用高沸點的有機溶劑為溶劑，因其出峰較晚故不會干擾測定[8］。而甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯均為中、低沸點的有機揮發性溶劑。因此，筆者參考上述文獻[8］，選擇N，N-二甲基甲酰胺為本研究的溶劑及稀釋劑。

3.3 有機溶劑殘留量測定結果分析

在原料藥合成生產過程中，未能完全去除的有機溶劑殘留量限度應符合2015年版《中國藥典》（四部）[4］中的相關規定:甲醇不得超過0.3%、乙醇不得超過0.5%、乙腈不得超過0.041%、異丙醇不得超過0.5%、甲苯不得超過0.089%、四氫呋喃不得超過0.072%、乙酸乙酯不得超過0.5%。其中，甲醇、乙腈、甲苯、四氫呋喃為二類藥品生產質量管理規范質量要求限制使用溶劑；乙醇、異丙醇、乙酸乙酯為三類限制使用溶劑。本研究中，甲醇、乙醇的測定結果均低于文獻[9］結果及2015年版《中國藥典》（四部）[4］中的相關規定，乙腈、異丙醇、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯在3批樣品中均未檢出，有機溶劑的殘留量符合2015年版《中國藥典》（四部）的要求。

此外，筆者參考相關文獻[10-15］，建立了采用GC法同時測定尼爾雌醇原料藥中7種有機溶劑的殘留量。經方法學驗證，該方法具有良好的系統適用性，可為尼爾雌醇質量標準的完善提供參考。

綜上所述，該方法靈敏度較高、準確度較好，可用于同時測定尼爾雌醇原料藥中甲醇、乙醇、乙腈、異丙烷、甲苯、四氫呋喃和乙酸乙酯的殘留量。