膽汁淤積性疾病中低氧誘導因子-2α對心肌營養素-1表達的調節作用*

陳 勇 華相偉 黃冰源 王綺夏 夏 強 馬 雄&

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化內科 上海市消化疾病研究所1(200001) 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院肝臟外科2 青島大學附屬醫院肝病中心3

背景：研究顯示心肌營養素-1(CT-1)在器官損傷保護以及糖、脂代謝等過程中具有重要調節作用。目的：探討膽汁淤積性疾病中低氧誘導因子(HIFs)對CT-1表達的調節作用。方法：2016年6月—2017年6月于上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院招募膽道閉鎖患兒23例，7名健康活體肝移植供體作為對照組。以免疫組化法和蛋白質印跡法檢測肝組織中的HIF-1α、HIF-2α、CT-1細胞定位和表達。在體外實驗中，予人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)強氧化劑H2O2處理，并以RNA干擾技術沉默HIF-2α表達，以蛋白質印跡法和real-time PCR檢測HIF-2α、CT-1表達變化。結果：在膽汁淤積患兒肝組織中，HIF-2α和CT-1共同分布于膽管細胞以及基質細胞如血管內皮細胞和炎性細胞，HIF-1α僅偶見于炎性細胞。與健康對照者的肝組織相比，膽汁淤積患兒肝組織中HIF-2α、CT-1表達明顯升高。H2O2誘導的氧化應激可顯著上調HUVEC HIF-2α、CT-1表達，HIF-2α siRNA則可在轉錄水平抑制H2O2誘導的CT-1表達。結論：在小兒膽汁淤積性疾病中，CT-1表達受HIF-2α而非HIF-1α調節。膽汁淤積進程中的氧化應激中存在HIF-2α依賴性的CT-1表達調節機制。

作為白細胞介素-6(IL-6)家族成員，心肌營養素-1(cardiotrophin-1, CT-1)已被證明可在多種病理生理過程中發揮多種功能[1-2]。早期研究主要闡述了CT-1對器官損傷的保護作用，如缺血再灌注損傷以及由其他有害因素引起的器官功能衰竭[3-4]，最近一些研究指出CT-1也可能參與調節葡萄糖和脂質代謝[5-7]。筆者所在團隊前期研究[8]還證實了CT-1在小兒膽汁淤積性肝病中的潛在促纖維化作用，然而其表達調節機制仍有待進一步探索。

氧化應激是多種膽汁淤積性疾病進展的共同特征，可驅動炎癥反應和纖維化[9-10]。低氧誘導因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)為堿性螺旋蛋白(basic helix-loop-helix, bHLH)-PAS家族成員，是氧化應激狀態下的重要轉錄因子[11-12]。HIF-1α和HIF-2α是HIFs的主要調節亞基，兩者既有共同的靶基因，如血管內皮生長因子(VEGF)和葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)[11,13]，又可調節各自特定的靶基因表達，如磷酸甘油酸酯激酶1(PGK1)和八聚體結合轉錄因子4(Oct-4)[14-15]。至于CT-1，有報道稱HIF-1ɑ參與了心肌細胞CT-1轉錄水平的表達上調[16]。本研究擬探討HIFs是否參與了膽汁淤積性疾病中CT-1表達的調節。

材料與方法

一、標本來源

于2016年6月—2017年6月招募行肝移植術的膽道閉鎖患兒23例，其中男性12例，女性11例，年齡(24.59±3.60)個月；膽汁淤積經手術和病理證實。對照組肝組織源自同期7名健康活體肝移植供體，其中男性3名，女性4名，年齡(25.86±2.55)歲，臨床診斷無肝臟相關疾病，無肝功能障礙癥狀或體征，無其他嚴重炎癥或全身性疾病。兩組肝組織標本均取材于肝移植術中。病例和對照均招募自上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，均簽署知情同意書。研究方案通過醫院倫理委員會審批。

二、細胞株、主要試劑和儀器

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC, ATCC)。HIF-1ɑ、HIF-2ɑ、CT-1抗體(Abcam plc.)；β-actin抗體、HRP標記IgG(Cell Signaling Technology)；Lipofect-amineTM2000轉染試劑、InvitrogenTMTRIzolTM試劑、ECL發光試劑盒(Thermo Fisher Scientific)；HIF-2α siRNA、對照siRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)；逆轉錄試劑盒、real-time PCR試劑盒(Takara Bio Inc.)；CT-1、β-actin PCR特異性引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。Applied BiosystemsTMABI PRISMTM7900HT序列檢測系統(Thermo Fisher Scientific)。

三、方法

1. 免疫組化染色：肝組織標本4%甲醛固定24 h，常規脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片；石蠟切片60 ℃烤片1 h，脫蠟水化，3% H2O2處理15 min以消除內源性過氧化物酶活性；枸櫞酸微波法行抗原修復，自然冷卻至室溫；滴加山羊血清封閉非特異性結合位點，室溫孵育30 min；分別加入HIF-1ɑ、HIF-2ɑ、CT-1一抗，4 ℃濕盒過夜后復溫30 min，PBS漂洗3次；滴加HRP標記的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，自然晾干，中性樹膠封片。

2. 細胞培養和處理：HUVEC加入含10%胎牛血清和青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基，置于25 mL 培養瓶中，在5% CO2、37 ℃細胞孵育箱中培養。根據需要以H2O2(0、50、100 μmol/L)處理24 h。參照試劑說明書制備轉染復合物(100 pmol siRNA+5 μL LipofectamineTM2000轉染試劑+500 μL Opti-MEM培養基)，轉染HUVEC。HIF-2α siRNA序列：F 5’-GCG CAA AUG UAC CCA AUG ATT-3’, R 5’-UCA UUG GGU ACA UUU GCG CTT-3’。

3. Real-time PCR：以TRIzol試劑提取經不同處理HUVEC的總RNA，逆轉錄合成cDNA，以之為模板，使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)行real-time PCR。引物序列：β-actin(內參)F 5’-TTG ACG GAA GGG CAC CAC CAG-3’, R 5’-GCA CCA CCA CCC ACG GAA TCG-3’; CT-1 F 5’-GGG AGG GAA GTC TGG ACC C-3’, R 5’-CCC GAA GGG GTC TCC CTG-3’。每組設3個復孔。2-△△CT法計算樣本目的基因mRNA相對表達量。

4. 蛋白質印跡法：制備肝組織勻漿或收集經不同處理的HUVEC，加入蛋白裂解液裂解10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法定量蛋白濃度。取40 μg總蛋白上樣，10% SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；分別加入HIF-2α、CT-1、β-actin一抗(工作濃度分別為1∶500、1∶500、1∶3 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜5 min×5次，加入二抗(工作濃度1∶5 000 )，常溫孵育1 h，ECL發光顯色。

四、統計學分析

結 果

一、膽汁淤積患兒肝組織HIF-1α、HIF-2α、CT-1表達的細胞定位

為研究HIFs是否調節CT-1表達，首先檢測膽汁淤積患兒肝組織中的HIFs和CT-1表達。免疫組化染色結果顯示HIF-1ɑ僅在一些炎性細胞中偶然可見，HIF-2α則在膽管細胞以及血管內皮細胞、炎性細胞等基質細胞的細胞核中廣泛表達，CT-1表現出與HIF-2α相似的表達分布(圖1)。上述結果提示膽汁淤積中的肝組織CT-1表達可能主要受HIF-2α而非HIF-1ɑ調節。

二、膽汁淤積患兒肝組織HIF-2α、CT-1表達升高

進一步采用蛋白質印跡法檢測肝組織HIF-2α、CT-1表達水平，結果顯示膽汁淤積患兒肝組織兩者表達與正常肝組織相比均明顯升高(圖2)。

三、H2O2刺激上調HIF-2α、CT-1表達

氧化應激在膽汁淤積進展中起重要作用。體外研究以強氧化劑H2O2處理HUVEC誘導氧化應激，蛋白質印跡法和real-time PCR檢測顯示，HUVEC HIF-2α蛋白表達上調(圖3A)，CT-1 mRNA和蛋白表達均上調(圖3A、3B)。

四、H2O2誘導CT-1表達上調依賴于HIF-2α

為確定HIF-2α對HUVEC CT-1基因的轉錄激活作用，以RNA干擾技術沉默HIF-2α表達，蛋白質印跡法檢測顯示，HIF-2α siRNA可顯著降低經H2O2(50 μmol/L)刺激的HUVEC中的HIF-2α、CT-1蛋白表達(圖4A)；更重要的是，real-time PCR檢測顯示CT-1 mRNA表達亦顯著下調(圖4B)。上述發現提示，在H2O2誘導的氧化應激中，HIF-2α在轉錄水平調節CT-1表達。

白色箭頭示膽管，黑色箭頭示血管內皮

圖2 膽汁淤積患兒和健康對照者肝組織HIF-2α、CT-1蛋白表達(蛋白質印跡法)

*兩組間比較，P<0.05

A：HIF-2α、CT-1蛋白表達上調(蛋白質印跡法)；B：CT-1 mRNA表達上調(real-time PCR)

圖3 H2O2處理后HUVEC HIF-2α、CT-1表達變化

**兩組間比較，P<0.01

A：HIF-2α、CT-1蛋白表達下調(蛋白質印跡法)；B：CT-1 mRNA表達下調(real-time PCR)

圖4HIF-2α siRNA處理后經H2O2(50 μmol/L)刺激的HUVEC HIF-2α、CT-1表達變化

討 論

現有研究已證明CT-1在器官損傷保護以及糖、脂代謝等過程中具有重要調節作用。筆者所在團隊還證實了CT-1在膽汁淤積中的促纖維化作用。本研究擬進一步探討膽汁淤積性疾病中CT-1表達的調節機制。

HIFs的HIF-1α和HIF-2α亞基在功能上雖有一定共性，但兩者也在許多病理生理過程中表現出獨特甚至相反的功能[14-15,17-19]，此種差異可能與兩者的表達模式不同有關。HIF-1α mRNA表達廣泛，HIF-2α mRNA表達則更多地限于特定組織，如內皮細胞和肺間質中[18]。免疫組化分析顯示HIF-2α在低氧狀態下的腦、心、肺、腎、肝、胰腺和腸組織特定細胞群中均有表達[20]。本團隊之前的研究[21]描述了HIF-2α在肝細胞中的作用，證明HIF-2α可促進膽汁淤積期間的肝細胞凋亡。本研究通過免疫組化染色發現HIF-2α在膽道閉鎖膽汁淤積患兒肝臟膽管細胞和基質細胞如血管內皮細胞中廣泛表達，同時觀察到CT-1的表達分布與HIF-2α相似。有趣的是，盡管先前研究[16]證實HIF-1α參與了小鼠心肌細胞的CT-1表達上調，但本研究發現HIF-1α在膽汁淤積中僅偶見于一些炎性細胞。蛋白表達水平的研究結果亦證實HIF-2α和CT-1在膽汁淤積患兒肝組織中表達升高。上述結果提示，在小兒膽汁淤積性疾病中，肝組織CT-1表達上調系受HIF-2α而非HIF-1α調節。

在膽汁淤積進程中，氧自由基相關氧化應激可激活多個促纖維化和炎癥反應關鍵信號通路[22]。HIF-2α是參與膽汁淤積的重要轉錄因子，可介導對氧化應激的初級轉錄反應[21]。 此外，氧自由基還有利于各種細胞因子和生長因子的合成和活化[22-24]。先前研究[16]發現氧化應激可刺激CT-1表達，后者作為反應性保護因子對細胞凋亡起保護作用。本研究體外實驗證實，強氧化劑H2O2處理可顯著上調HUVEC的HIF-2α和CT-1蛋白表達，沉默HIF-2α則可在轉錄水平抑制H2O2誘導的CT-1表達，提示了氧化應激下CT-1轉錄上調的HIF-2α依賴性機制。目前已有證據證明HIF-2α活化可促進纖維化進程[25-26]，而本研究發現HIF-2α參與介導了氧化應激誘導的CT-1表達上調，由此發揮促纖維化作用。因此，HIF-2α可能分別通過直接和間接途徑促進纖維化發生。

綜上所述，本研究結果表明，在小兒膽汁淤積性疾病中，CT-1表達受HIF-2α而非HIF-1α調節；膽汁淤積進程中的氧化應激中存在HIF-2α依賴性的CT-1表達調節機制，該機制有望成為膽汁淤積性疾病的新型治療靶點。