新生大鼠哺乳期間斷吸入七氟烷對老年期行為學及海馬ApoE的影響*

吳振宇，謝 笛，唐春春，朱宇航，朱昭瓊△

(1.遵義醫學院附屬醫院麻醉科，貴州遵義 563000；2.貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州遵義 563000；3.貴州省遵義市第一人民醫院ICU，貴州遵義 563000)

嬰幼兒時期是大腦發育的關鍵時期，該時期機體的中樞神經系統對于內外環境的變化異常敏感[1]。小兒智力發育狀況直接關系其未來成長的遠期結果，但由于疾病、創傷、意外等多重風險因素的存在，不同年齡的小兒可能面臨需要在全身麻醉下進行一次或多次的醫學檢查及治療。目前已有研究表明老年患者接受七氟烷麻醉后可出現顯著持久的認知功能障礙[2]。但臨床常用小兒全身麻醉藥七氟烷麻醉后，對嬰幼兒時期大腦發育及遠期的認知功能的影響目前鮮有報道。載脂蛋白E(apolipoprotein-E，ApoE)及其基因型的異常表達是目前較為公認的影響老年期認知功能的重要因素[3]，然而對其他年齡段影響不明。故本實驗觀察哺乳期大鼠間斷吸入七氟烷麻醉后，哺乳期、老年期行為學變化及海馬ApoE變化差異，探討間斷吸入七氟烷麻醉影響大鼠海馬ApoE變化與不同時期認知功能的改變，并探索其機制。

1 材料與方法

1.1主要藥品、試劑與儀器 七氟烷(批號：65130704，山東魯南貝特制藥有限公司)；ApoE一抗(北京奧博森生物技術有限公司)；GTVision Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組織化學試劑盒(上海基因科技有限公司)；Trizol、PrimeScript RTReagent Kit(TaKaRa公司，日本)；iQ SYBR GreenSupermix(Bio-Rad公司，美國)；Fabius麻醉機、Va-mos氣體監測儀(Draeger公司，德國)；自制吸入麻醉箱；Morris水迷宮測試儀(成都泰盟科技有限公司)；顯微鏡(Olympus公司，日本)；CFX熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(Bio-Rad公司，美國)。

1.2動物選擇及分組 新生7日齡SD大鼠48只，雌雄不拘，由重慶第三軍醫大學實驗動物中心提供[SCXK(渝)2012-0005]。依照體質量及大鼠年齡采用隨機數字表法分為4組，即間斷七氟烷麻醉哺乳期(P0～P37)組(Sev1組，n=12)、哺乳期對照組(Con1組，n=12)、間斷七氟烷麻醉老年期(P600～P606)組(Sev2組，n=12)及老年期對照組(Con2組，n=12)。Sev1、2組分別于出生后第7天(P7)、第14天(P14)、第21天(P21)經七氟烷處理：將自制吸入麻醉箱(75 cm×40 cm×15 cm)進、出氣口連接麻醉機及氣體監護儀，調節氣體流量及七氟烷揮發罐完成箱內氣體平衡，待進出氣口七氟烷濃度穩定于2.6%后放入大鼠，并維持2.6%七氟烷濃度麻醉2 h；Con組在上述時間點分別吸入空氧混合氣體(空氣1 L/min+ O21 L/min)2 h。麻醉結束待自然蘇醒后放回原飼養籠喂養。飼養環境相對濕度50%～60%，溫度20～24 ℃，自然晝夜循環光照，母乳喂養。

1.3認知功能測定 Sev1組、Con1組于第31～37天進行Morris水迷宮實驗，包括l d的適應性訓練、5 d的定位航行實驗和1 d的空間探索實驗。定位航行實驗：每天4次，將平臺設置為低于水面1.5 cm。依次從4個象限的盆壁中點將大鼠面向盆壁放入水中，以大鼠120 s內找到并爬上平臺時間記錄為逃避潛伏期。若120 s內沒有找到平臺，則指引其找到并置于平臺上休息20 s后再次實驗。若大鼠3次均未能爬上平臺，將予以剔除。空間探索實驗：實驗第6天，撤去平臺，大鼠從原平臺象限的對側象限入水，游泳120 s，記錄原平臺象限滯留時間百分比，原平臺象限運動距離百分比，原平臺象限進入次數百分比。Sev2組(n=12)、Con2組(n=12)于20個月完成上述相同實驗。

1.4海馬ApoE mRNA表達的檢測 水迷宮實驗結束后立即取材，每組各6只腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后取海馬組織，置于0.5 mL Trizol液中，用研杵充分勻漿至組織完全裂解，加入氯仿0.2 mL，快速搖勻，4 ℃以12 000 r/min離心10 min，取出上清液，加0.2 mL異丙醇搖勻后，室溫靜置10 min，4 ℃以12 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入75%乙醇0.5 mL，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，棄上清液。將EP管倒置于濾紙上室溫下自然干燥，以去酶水50 μL溶解。采用紫外分光光度計測定吸光度值(A260/A280)。根據GenBank中目的基因全序列，使用Primer Premier5.0軟件自行設計引物，ApoE mRNA上游引物：5′-GTG CAG ACG CTT TCT GAC C-3′,下游引物：5′-CTT CCG TCA TAG TGT CCT CCA TC-3′。熒光定量PCR反應體系為ddH2O 7.6 μL,SYBR 10 μL,上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，DNA模板1.6 μL，每管共計20 μL。PCR反應條件：95.0 ℃預變性10 s；95.0 ℃ 5 s，60.6 ℃ 20 s，循環40次；55.0 ℃開始，每0.5 ℃采集10 s熒光。采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達水平。

1.5海馬ApoE、ApoE4表達的檢測 水迷宮結束后立即取材，將兩組實驗動物每組各6只，腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后處死，取出腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后石蠟包埋切片、脫蠟、復水、抗原修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加一抗。次日復溫，PBS沖洗3次后孵育二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。400倍光鏡下進行半定量分析，每張切片選取海馬CAl區、CA3區和DG區，每區選取4個視野，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件檢測144個(1蛋白×12標本×3區×4視野=144)視野A值，以平均A值反映ApoE、ApoE4的表達水平。

2 結 果

2.1水迷宮實驗結果

2.1.1定位航行實驗 隨實驗時間增加，各組大鼠逃避潛伏期呈縮短趨勢，其中Sev1組與Con1組比較差異無統計學意義(P>0.05)。實驗數據第3天Sev2組大鼠與Con2組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 哺乳期組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較

2.1.2空間探索實驗 Sev1組與Con1組相比較，Sev2組與Con2組相比較，原平臺象限滯留時間百分比、原平臺象限運動距離百分比、原平臺象限進入次數百分比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2熒光定量PCR結果 Sev1組與Con1組比較，Sev2組與Con2組比較，大鼠海馬ApoE mRNA表達均明顯上調(P<0.05)。見表2。

2.3免疫組織化學實驗結果

2.3.1大鼠海馬ApoE蛋白表達結果 與Con1組比較，Sev1組海馬CAl區和CA3區ApoE表達上調(P<0.05)，DG區ApoE表達差異無統計學意義(P>0.05)。與Con2組比較，Sev2組大鼠海馬各分區ApoE蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

a：P<0.05，與Con2組比較

圖2 老年期組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較

表2 海馬ApoE表達水平比較

a：P<0.05，與Con1組比較；b：P<0.05，與Con2組比較

2.3.2大鼠海馬ApoE4蛋白表達比較結果 Sev1組與Con1組比較，Sev2組與Con2組比較，大鼠海馬各分區ApoE4蛋白表達差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

組別CA1區CA3區DG區Sev1組0.197±0.0310.202±0.0180.192±0.026Con1組0.198±0.0210.203±0.0270.152±0.016Sev2組0.124±0.0360.134±0.4220.152±0.072Con2組0.115±0.0150.142±0.0470.132±0.048

3 討 論

全身麻醉與認知功能變化的研究一直是醫學界的熱點話題。七氟烷因其藥理特性的優勢，已成為小兒全身麻醉藥的常用藥物之一。小兒由于語言表達能力、客觀事物反應能力的受限性，圍術期通常難以配合醫務人員或學者的觀察，所以目前的臨床研究中罕有小兒經麻醉后出現認知功能障礙的報道。然而患兒家長及學者們依然擔心全身麻醉會對小兒未來的認知能力產生影響。目前臨床應用于嬰幼兒的七氟烷濃度為2.6%左右[4]，且七氟烷的臨床99%有效濃度為1.3 MAC，通過換算，濃度也為2.6%。而新生期大鼠七氟烷最低肺泡有效濃度(minimum alveolar concentration，MAC)值約2.0%[5]。故參考文獻[6]，本研究于新生大鼠7、14、21 d間斷重復吸入2.6%七氟烷麻醉建立動物模型，以模擬臨床上接受七氟烷麻醉患兒，觀察近期及遠期行為學相關的變化，并探討其可能機制。

目前用于檢測認知功能經典的行為學方法是Morris水迷宮實驗，參照文獻[7]，本研究采用Morris水迷宮實驗檢測哺乳期及老年期大鼠認知功能。本實驗中未發現先天愚型大鼠。定位航行試驗檢測大鼠陳述性記憶能力，陳述性記憶屬于外顯記憶，海馬和內側顳葉是其核心腦區[8]。由Morris水迷宮實驗可發現，其與逃避潛伏期呈負相關[9]，即陳述性記憶能力強，則逃避潛伏期短。逃避潛伏期延長，反映大鼠陳述性記憶能力受到損害。本實驗結果顯示，哺乳期大鼠逃避潛伏期隨訓練時間增加呈縮短趨勢，組間比較差異無統計學意義。老年期大鼠逃避潛伏期隨時間增加呈縮短趨勢，定位航行實驗第3天Sev2組逃避潛伏期相對Con2組時間延長(P<0.05)，但隨著訓練時間的增加，兩組大鼠逃避潛伏期差異無統計學意義。空間探索實驗主要檢測空間聯想和回憶能力[10]，是對之前定位航行實驗中記憶信息的再提取。本研究發現，哺乳期大鼠、老年期大鼠原平臺滯留時間百分比、原平臺運動距離百分比、原平臺進入次數百分比差異均無統計學意義(P>0.05)。表明吸入2.6%七氟烷麻醉對核心腦區的記憶輸出功能并不造成影響。本研究行為學實驗表明，新生期大鼠間斷七氟烷麻醉對其老年期陳述性記憶可能存在影響，但這種影響隨著訓練時間的增加是可逆的，對大鼠的記憶提取能力沒有影響。

目前，國內外均有研究表明ApoE及其基因型是發生認知功能障礙的易感基因，也是引起阿爾茨海默病(AD)的危險因素，其與認知功能障礙的慢性演化甚至進展為AD密切相關[11-12]。ApoE分為3種亞型，分別為ApoE2、ApoE3及ApoE4。有研究發現，中樞神經系統中，ApoE作為膽固醇載體運輸的脂質對軸突生長有重要作用，ApoE4可降低腦中脂質代謝水平并導致脂質異常，從而促進認知障礙的發生[13]。HANSON等[14]研究也指出，ApoE與Aβ的清除代謝密切相關，Aβ是大腦“老年斑”形成的重要誘因，ApoE可通過分子伴侶的形式與Aβ結合，影響星形細胞和神經元對Aβ的清除，導致老年斑形成和神經細胞凋亡，從而引起認知功能障礙，且Apo4攜帶者清除能力弱于Apo3，故Apo4更易引起Aβ的沉積，使海馬/腦內的“老年斑”沉積增加，進而促進認知功能障礙的發生。本研究中發現，間斷吸入2.6%七氟烷后，哺乳期、老年期海馬ApoE mRNA表達均明顯上調(P<0.05)。ApoE mRNA是蛋白質合成的模板，在ApoE的生成過程中有重要作用，故ApoE mRNA表達量的增高可能提示局部組織蛋白質的變化。進一步對比各組大鼠海馬各分區ApoE蛋白表達變化發現，Sev1組大鼠CA1區、CA3區ApoE蛋白表達水平較Con1組明顯上調(P<0.05)。海馬CA1區是學習記憶信號在海馬的主要輸出區域[15]。CA3區是聯想記憶產生的重要腦區，分為自聯想和異聯想記憶[16]。而Sev2組大鼠海馬各分區ApoE蛋白表達水平比較差異無統計學意義。再進一步分析大鼠海馬各分區ApoE4蛋白表達比較分析差異無統計學意義(P>0.05)。通過對比發現，間斷吸入七氟烷后，短期內可以導致大鼠海馬ApoE上調，提示間斷吸入七氟烷有產生一過性神經毒性及認知功能障礙的可能性，但隨著時間的增加，這種神經毒性可以通過某種途徑自行被消除。分析其原因可能與ApoE基因多態的功能特異性有關，本課題組前期研究表明ApoE2等位基因與AD的危險性下降有關[17]。也有研究指出ApoE3可增加Tua蛋白的穩定性，促進神經元的生長等[18]。故推測哺乳期大鼠接受間斷七氟烷麻醉后，其可能存在ApoE2、ApoE3表達的升高，可能與認知功能障礙的產生呈負相關。這種ApoE多態性基因的相互作用也可能與七氟烷暴露時間及濃度存在相關性。且本實驗中哺乳期及老年期大鼠ApoE4檢測未見異常表達，可以認為不必擔心有與此機制相關的認知障礙發生。本實驗中哺乳期大鼠間斷2.6%七氟烷麻醉雖然在大鼠幼年期引起了海馬ApoE改變，但未造成老年期大鼠海馬ApoE異常及明顯行為學改變，提示該濃度七氟烷麻醉對發育中大鼠大腦的影響是短暫性的，并不影響遠期行為學。文獻[19]的觀點與本實驗結果一致。這也符合朱霞等[20]認為七氟烷影響認知功能的效應是短期的、一過性的推測。

綜上所述，哺乳期大鼠間斷2.6%七氟烷麻醉后，可對大鼠海馬ApoE產生短暫影響，但并不足以造成大鼠老年期海馬ApoE異常及明顯的行為學改變，可為臨床使用該濃度七氟烷提供參考。同時本研究也存在一定不足之處，筆者將進一步探究新生期及老年期大鼠吸入七氟烷后海馬ApoE多態性的變化，以及對其他認知功能相關基因及蛋白進行進一步定性、定量分析，更深層次地探討七氟烷吸入麻醉與認知功能改變的相關機制。