貴州非阻塞性無精癥與易感基因多態(tài)性的相關(guān)研究*

王嬋娟，何 燕，張 婷，單可人，禹文峰，官志忠，安 宇

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550004;2.貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550004;3.貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550002)

臨床調(diào)查顯示世界范圍內(nèi)約有5%的夫婦受到不孕的困擾，其中有50%是由于男性不育而造成[1]，其中非阻塞性無精癥(non-obstructive azoospermia，NOA)是最常見的男性不育癥類型之一，其發(fā)病率在成年男性中高達(dá)1%，該病的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，目前尚無十分有效的防治手段，給家庭社會(huì)帶來的危害巨大[2]。越來越多的研究顯示遺傳因素如影響精子發(fā)育的基因與NOA相關(guān)[3-11]。近年來，對(duì)NOA全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究發(fā)現(xiàn)了一些潛在的易感基因位點(diǎn)，分別是位于1p13.30、1p36.32、12p12.10及20p13.00的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，它們分別對(duì)應(yīng)了PRMT6、PEX10/MMEL1、SOX5和LOC100289473/SIRPA/SIRPG幾個(gè)相關(guān)基因[12]。目前這些位點(diǎn)與無精癥之間的相關(guān)性并不十分明確，本研究對(duì)貴州人群NOA患者及正常健康對(duì)照人群中上述易感基因的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)性分析，得到其基因型頻率的分布狀況，并探討易感基因的SNP與NOA的關(guān)聯(lián)，以期為早期診斷和干預(yù)提供一定的依據(jù)和線索。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究在知情同意的原則下隨機(jī)抽取貴州省人民醫(yī)院臨床確診的NOA患者病例(疾病組)以及正常健康體檢人群(對(duì)照組)為研究對(duì)象，研究對(duì)象均為漢族人群，樣本總量319 例，其中對(duì)照組174例，年齡(48.3±12.9)歲，疾病組145例，年齡(46.5±20.2)歲。入選的疾病組人群平均不育年限(4.5±1.2)年，臨床檢查已排除精索靜脈曲張、生殖道梗阻、隱睪、附睪損傷等其他泌尿生殖系統(tǒng)疾患，且無特殊病史及家族史，經(jīng)精液檢查，均確診為NOA。研究對(duì)象組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 (1)試劑：人基因組rs12097821(G/T)、rs2477686(G/C)、rs10842262(G/C)及rs6080550(C/T)SNP位點(diǎn)TaqMan探針分型試劑盒[TaqMan?SNP Genotyping Assays，英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司]。(2)儀器：DU 640蛋白質(zhì)核酸定量分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。ABI StepOne Plus反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取與定量 對(duì)研究人群全血采用酚/氯仿抽提法抽提基因組DNA，后TE(Tris和乙二胺四乙酸緩沖液)溶解，DU640核酸蛋白分析儀測(cè)定計(jì)算DNA的含量，同時(shí)檢測(cè)DNA樣品的純度，將每個(gè)標(biāo)本稀釋成20 ng/μL的應(yīng)用液。

1.3.2SNP位點(diǎn)的TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用人基因組rs12097821(G/T)、rs2477686(G/C)、rs10842262(G/C)及rs6080550(C/T)SNP位點(diǎn)TaqMan探針分型試劑盒進(jìn)行基因分型，PCR擴(kuò)增體系為10.00 μL，含DNA模板1.50 μL、2×TaqMan Genotyping Master Mix 5.00 μL、40×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix 0.25 μL、ddH2O 3.25 μL。ABI StepOne Plus RT-PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每96孔板設(shè)置3個(gè)空白對(duì)照(NTC)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；92 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。ABI StepOne Plus RT-PCR儀在上述PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行等位基因識(shí)別分析，兩個(gè)位點(diǎn)均設(shè)置FAM、VIC探針和樣品孔、3個(gè)NTC空白對(duì)照，運(yùn)用StepOne Software v2.1軟件，讀取熒光信號(hào)，通過X、Y軸散點(diǎn)圖分析各樣本的基因型。根據(jù)StepOne Software v2.1軟件分析結(jié)果，對(duì)每種基因型隨機(jī)選取樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，每個(gè)基因型選取2～3個(gè)樣本，而對(duì)StepOne Software v2.1軟件未能直接分型的樣本，則直接測(cè)序。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 根據(jù)StepOne Software v2.1軟件分析和測(cè)序結(jié)果確定樣本的基因型，基因型頻率和等位基因頻率用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。組間基因型頻率和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SNPstats軟件對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，SHEsis軟件構(gòu)建SNP單倍型并統(tǒng)計(jì)其頻率分布。

2 結(jié) 果

2.1各個(gè)SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率統(tǒng)計(jì)分析 在對(duì)照組人群中4個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.064、0.170、1.000、1.000)，見表1、2。在檢測(cè)的4個(gè)SNPs多態(tài)性位點(diǎn)中，rs2477686(G/C)、rs12097821(G/T)及rs6080550(C/T)基因型頻率分布在疾病組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。疾病組rs2477686多態(tài)性位點(diǎn)C等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，疾病組rs12097821和rs6080550多態(tài)性位點(diǎn)的T等位基因頻率也分別顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而rs10842262位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布在疾病組與對(duì)照組中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另一方面，基因型頻率結(jié)果顯示rs2477686(C/C)、rs12097821(T/T)及rs6080550(A/A)分別增加人群中的NOA患病風(fēng)險(xiǎn)，OR值分別為2.64、2.61及13.52，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表1 SNP位點(diǎn)基因型分布[n(%)]

續(xù)表1 SNP位點(diǎn)基因型分布[n(%)]

表2 SNP位點(diǎn)等位基因頻率分布[n(%)]

2.2連鎖不平衡分析與單倍型分析 由于rs2477686(G/C)、rs12097821(G/T)分別位于1號(hào)染色體短臂的3區(qū)6帶和1區(qū)3帶，故采用SNPstats軟件對(duì)疾病組與對(duì)照組的上述2個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析。結(jié)果顯示，疾病組與對(duì)照組各位點(diǎn)之間存在連鎖不平衡現(xiàn)象，且具有較強(qiáng)的連鎖程度(D′=0.052，D′>0.05)。應(yīng)用SHEsis軟件對(duì)上述2個(gè)連鎖不平衡的SNP位點(diǎn)構(gòu)建單倍型并統(tǒng)計(jì)其在疾病組與對(duì)照組中的頻率分布。結(jié)果 rs2477686與rs12097821構(gòu)建的C-T單倍型頻率分布在疾病組及對(duì)照組中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，OR值為2.972，95%CI(1.645～5.372)。見表4。

表3 4個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率患病風(fēng)險(xiǎn)OR值[n(%)]

表4 1號(hào)染色體單倍型頻率分布分析

3 討 論

無精癥的原因復(fù)雜多樣，一般分為阻塞性無精癥(obstructive azoospermia，OA)和NOA。綜合各文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果，NOA患者占男性不育者6%～26%。NOA是特發(fā)性男性不育的重要原因之一，其發(fā)病機(jī)制到目前為止不十分清楚，除去睪丸缺乏生精細(xì)胞外，大多無精癥睪丸病理表現(xiàn)為生精停滯[13]。基于此，臨床和科研人員投入大量的精力去研究無精癥患者中精子發(fā)生相關(guān)基因的是否異常，以期找到發(fā)病的原因，從而達(dá)到干預(yù)治療無精癥的目的[14]。盡管早期研究發(fā)現(xiàn)Y染色體的微缺失可以直接導(dǎo)致NOA，然而越來越多的臨床實(shí)踐表明Y染色體的微缺失只是原因之一，其他許多遺傳因素如影響精子發(fā)育的基因也與之相關(guān)[3-11]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)了許多與NOA相關(guān)聯(lián)的基因如SPO11、EIF5A2、NR5A1、ART3、ZNF230、COX1O、MTHFR等，但研究都存在樣本規(guī)模較小的問題，研究數(shù)據(jù)具有一定局限性，且所研究的基因與疾病的關(guān)聯(lián)程度判斷的主觀因素大，存在很大的片面性[15-16]。目前這些研究的不足之處可以采用全基因組關(guān)聯(lián)研究技術(shù)進(jìn)行彌補(bǔ)。SNP作為人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，位于基因調(diào)控區(qū)和精氨酸編碼區(qū)可影響基因表達(dá)、引起蛋白結(jié)構(gòu)改變、造成個(gè)體差異，已成為多基因疾病關(guān)聯(lián)研究的熱點(diǎn)。在一項(xiàng)NOA全基因組關(guān)聯(lián)分析研究中，通過GWAS分析揭示了4種全新的中國(guó)人群NOA易感基因位點(diǎn)，該研究收集了中國(guó)男性人群2 927例NOA患者和5 734例健康對(duì)照，并且從906703個(gè)SNP位點(diǎn)中篩選確定分別位于染色體1p13.30、1p36.32、12p12.10和20p13.00的4個(gè)SNP位點(diǎn)，上述位點(diǎn)在NOA和正常群體存在顯著性變異；該研究認(rèn)為這些區(qū)域是導(dǎo)致NOA發(fā)生的遺傳易感因素，而在這些區(qū)域中PRMT6、PEX10/MMEL1、SOX5和LOC100289473等相關(guān)基因可能與NOA關(guān)聯(lián)最緊密[12]。但這些位點(diǎn)與無精癥之間的相關(guān)性還不是十分明確，各個(gè)位點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)也不十分清晰。

本研究對(duì)貴州人群NOA與正常人群進(jìn)行了上述相關(guān)的位點(diǎn)多態(tài)性研究，在檢測(cè)的4個(gè)SNPs多態(tài)性位點(diǎn)中，rs2477686(G/C)、rs12097821(G/T)及rs6080550(C/T)基因型頻率分布在貴州人群疾病組與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。疾病組rs2477686多態(tài)性位點(diǎn)C等位基因顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，疾病組rs12097821和rs6080550多態(tài)性位點(diǎn)的T等位基因和A等位基因也分別顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而rs10842262位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布在疾病組與對(duì)照組中的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果提示rs2477686、rs12097821及rs6080550位點(diǎn)多態(tài)性與貴州人群NOA可能存在一定的相關(guān)性，攜帶rs2477686 C等位基因、rs12097821 T等位基因及rs6080550 T等位基因者可能使NOA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。

另一方面，連鎖不平衡分析與單倍型分析結(jié)果顯示：rs2477686與rs12097821構(gòu)建的C-T單倍型頻率分布在疾病組及對(duì)照組中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示單倍型C-T具有增加NOA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。而其他的單倍型頻率組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示與疾病患病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)性較小。

本研究提示rs2477686、rs12097821及rs6080550位點(diǎn)多態(tài)性與貴州人群NOA可能存在一定的相關(guān)性，攜帶rs2477686 C等位基因、rs12097821 T等位基因及rs6080550 T等位基因者可能使NOA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。rs12097821位點(diǎn)與PRMT6基因有關(guān)，而LUO等[17]最近發(fā)現(xiàn)PRMT6 能夠被雄激素受體下調(diào)，并且調(diào)控生精細(xì)胞的遷移以及凋亡，從而推測(cè)出其能在精子發(fā)生過程中扮演者重要的角色。rs2477686與基因PEX10關(guān)聯(lián)，CHEN等[18]發(fā)現(xiàn)果蠅PEX2與PEX10在果蠅的雄性生育中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。rs6080550與基因SIRPA/SIRPG相關(guān)，LU等[19]發(fā)現(xiàn)SIRPA/SIRPG 的蛋白編碼區(qū)的突變與NOA有關(guān)。

綜上所述，上述這些3個(gè)SNP相關(guān)位點(diǎn)周圍存在著與NOA發(fā)病相關(guān)的基因，提示和NOA的發(fā)病密切相關(guān)，但是確切的關(guān)系和發(fā)病機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究，而且SNP位點(diǎn)附近是否存在其他新的基因或者表達(dá)調(diào)控元件都值得進(jìn)一步探索。這些研究的結(jié)果將為早期診斷和干預(yù)提供一定的依據(jù)和線索，以期最終達(dá)到減少不孕不育、提高人口素質(zhì)的目標(biāo)，具有重要的臨床意義和社會(huì)意義。