三苦滴丸對大鼠心肌缺血再灌注損傷和心肌細胞凋亡的保護作用研究*

孫 野，舒遵華

(1.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院醫(yī)療保險辦公室,長春 130021)

冠心病在中醫(yī)范疇內屬于“胸痹心痛”[1]。該病名最早記載于《靈樞·五邪》：“邪在心，則病心痛。”在《素問·臟氣法時論》：“心病者，胸中痛，脅支滿，脅下痛，膺背肩胛間痛，兩臂內痛。”“真心痛，手足青至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死。”《素問·繆刺論》又稱為“厥心痛”“卒心痛”[2]。前期階段性研究表明，三苦滴丸對異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血顯著改善，通過抗氧自由基、抑制炎性介質浸潤等起作用[3]。本研究通過觀察三苦滴丸對大鼠造模后心肌細胞死亡、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平的影響，驗證三苦滴丸的療效，為研制冠心病心絞痛治療新藥提供科學依據(jù)，為臨床冠心病心絞痛癥狀緩解提供客觀、有效、不良反應小的科學方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 吉林大學藥學院提供Wistar大鼠70只，體質量250～270 g，雌雄各半。合格證號：SCXK-(吉)2007-0003。

1.1.2藥物及儀器 復方丹參滴丸(國藥準字：Z10950111；天津天士力制藥股份有限公司)，長春中醫(yī)藥大學研發(fā)中心提供三苦滴丸(試驗室批號：20180128；主要成分：三七、苦碟子)，南京建成生物工程研究所提供MDA、SOD，山東利爾康消毒股份有限公司生產(chǎn)碘伏消毒液，天津天泰精細品化學品有限公司生產(chǎn)乙醚。德國Bifuge stratos 生產(chǎn)的臺式高速冷凍離心機。美國伯樂公司生產(chǎn)的BIO0680酶標儀，上海第二天枰儀器廠生產(chǎn)的MP120-1型電子天平。

1.2方法

1.2.1分組 將70只雄性Wistar大鼠分為分為空白組(n=10)、模型組(n=10)、假手術組(n=10)、陽性對照組(復方丹參滴丸,n=10)、給藥組(三苦滴丸),給藥組再分為高、中、低劑量組,每組10只。給藥組再分為高、中、低劑量組。陽性對照組和給藥組連續(xù)給藥7 d，其他組給予等量蒸餾水，于第8天造模。

1.2.2造模 以1.5%戊巴比妥鈉溶液(0.005 mL)麻醉大鼠后，取仰臥位并于操作臺固定，對大鼠心臟情況采用心電圖記錄，連接呼吸機，于大鼠胸部行橫行切開，肌肉層鈍性分離，胸骨顯露，距離胸骨0.5 cm左緣處，將胸腔在第4肋間打開，心包剪開，包膜撕開，在距離左冠狀動脈2.5 mm處進針，將左心耳和肺動脈圓錐予以帶線縫合，假手術組不進行結扎，模型組、陽性對照組、給藥組大鼠均結扎左冠脈的左前降支致缺血，缺血0.5 h后行再灌注2 h。

1.2.3實驗藥物給藥 三苦滴丸按新的制備工藝進行制備，0.3克/粒，按照藥物出膏率30%的比例計算，正常人每日用藥12 g/d，按照人與大鼠體表面積核算，低、中、高劑量組分別為120、240、360 mg·kg-1·d-1；陽性對照藥物為復方丹參滴丸,規(guī)格：每丸27 mg，用時以蒸餾水稀釋成所需濃度。劑量為30 mg·kg-1·d-1。模型組、空白組：給予等體積蒸餾水4 mL，以上各組每天灌胃1次，每只動物均灌胃4 mL，共1周。

1.2.4指標檢測

1.2.4.1Western blot 檢測 每組取6只大鼠，依據(jù)試劑說明書提取蛋白，以蛋白定量檢測法(bicinchoninic acid，BCA)繪制標準蛋白稀釋濃度曲線，計算蛋白濃度并調整，后上樣，設定電泳條件，轉印至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，采用封閉液在室溫條件下封閉。加一抗(1∶1 000) 孵育過夜，以磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered solution，PBST)沖洗，加二抗，室溫孵育，PBST沖洗后顯色曝光，掃描顯色圖片采用購自上海天能科技有限公司的Gel Image System Ver．4.00軟件行灰度分析，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.2.4.2血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)測定 大鼠再灌注2 h 后處死，取3 mL大鼠心尖血，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，后取上清液測CK-MB水平，嚴格按說試劑盒明書操作。

1.2.4.3心肌組織SOD、MDA測定 在取心尖血后以生理鹽水洗凈心臟殘血，剪取大鼠缺血區(qū)心肌制成10%組織勻漿液，測SOD、MDA水平，嚴格按試劑盒明書操作。

1.2.4.4細胞凋亡檢測 將大鼠心臟組織制作石蠟切片，將組織切片、脫蠟，蛋白酶K中孵育脫水，避光加稀釋液、TUNEL反應液，室溫中放置1 h，并在37℃烤箱中放置30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobezidin，DAB)顯色，最后自來水稍洗脫水、透明、封片顯微鏡觀察、拍照，找到凋亡細胞區(qū)，后隨機取每張切片5個高倍視野，計算視野中的凋亡細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比，取平均值為凋亡指數(shù)。

2 結 果

2.1血清MDA、SOD、CK-MB的檢測 與空白組比較，模型組、陽性對照組、假手術組及高、中、低劑量組的MDA、CK-MB水平均顯著增高。除假手術組外，其余組SOD水平均顯著減低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量組的MDA、CK-MB水平顯著低于中、低劑量組，SOD水平顯著高于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2Cleaved-Caspase3、Bcl-2、細胞凋亡數(shù)、核因子(NF)-κB蛋白的檢測 與模型組比較，陽性對照組，假手術組，高、中、低劑量組的Bcl-2水平均顯著升高，而Cleaved-Caspase3、細胞凋亡數(shù)、NF-κB水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量組的Cleaved-Caspase3、細胞凋亡數(shù)、NF-κB水平顯著低于中、低劑量組，Bcl-2水平顯著高于中、低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖1。

表1 各組心肌缺血大鼠血清MDA、SOD、CK-MB水平

a：P<0.05，與空白組比較

表2 各組心肌缺血大鼠Cleaved-Caspase3、Bcl-2、細胞凋亡數(shù)水平‰)

a：P<0.05，與空白組比較

A：空白組；B：模型組；C：陽性對照組；D：低劑量組；E：中劑量組；F：高劑量組

圖1三苦滴丸對大鼠心肌細胞凋亡的影響(TUNEL染色×40)

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/R)是心肌組織在長時間缺血后恢復血液灌流，反而出現(xiàn)比再灌注前更嚴重的損傷和功能障礙[3-4]。迄今為止，經(jīng)研究在心肌缺血方面取得了一定的進展，其機制研究存在多種假說，主要包括氧自由基的生成、鈣超載、能量代謝障礙、細胞凋亡、壞死和自噬，血小板聚集和微血栓，免疫激活和炎性反應等[5-6]。近年來，在心肌缺血再灌注損傷的方面進行了深入的研究[7-8]。

本研究探析三苦滴丸對大鼠心肌缺血再灌注損傷和心肌細胞凋亡的緩解技術研究，結果與孫鳳娟等[9]的研究結果大體一致。近年來，國內外學者對苦碟子進行了大量研究工作，發(fā)現(xiàn)苦碟子的化學成分十分復雜[10-11]。心臟內存在大量的酶類物質完成心臟的正常生理功能，因心肌缺氧缺血損傷及細胞膜的通透性增高，促使心肌內含有的天門冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、CK-MB、肌酸激酶等大量釋放入血，促使血清中濃度增高。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組的MDA、CK-MB水平顯著低于中、低劑量組，SOD水平顯著高于中、低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明三苦滴丸可改善心肌缺血模型大鼠心肌酶CK、CK-MB有改善作用，減輕心肌損傷，其中三苦滴丸高劑量組效果更佳。心肌缺血的發(fā)生、發(fā)展及轉歸中，信號轉導可以調控心肌細胞的損傷，心肌缺血時存在復雜而廣泛的信號傳導系統(tǒng)交匯，并對缺血心肌發(fā)揮網(wǎng)絡調控作用。NF-κB是Rel蛋白家族成員，可與免疫球蛋白重鏈及κ輕鏈基因增強子序列特異結合。NF-κB是由p65級多肽p50亞基形成的二聚體，包括異源性或同源性二聚體，最常見及最多發(fā)揮生理功能的是p50～p65異源二聚體。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組的Cleaved-Caspase3、細胞凋亡數(shù)、 NF-κB水平顯著低于中、低劑量組，高劑量組的Bcl-2水平顯著高于中、低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示三苦滴丸可升高心肌組織內的NF-κB蛋白表達水平，進而對NF-κB水平產(chǎn)生抑制作用，減輕心肌缺血。臨床試驗和藥理學研究表明，苦碟子有心血管、抗腫瘤和降血脂等多方面的生物活性[12-13]。經(jīng)化學分析，其主要成分為黃酮類及腺苷類物質。在心血管疾病方面，苦碟子對擴張冠狀血管有顯著療效，可改善心肌微循環(huán)和增加冠脈血流量；研究證明苦碟子在心、腦血管方面具有顯著的療效[14-15]。苦碟子現(xiàn)常用于治療冠心病、缺血性腦血管疾病，有效率達93.3%。較治療前差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，血瘀癥患者血液流變學相關指標及血管內皮素的水平增高，證明了苦碟子確切的活血化瘀功效[16-18]。表明三苦滴丸能通過作用Caspase蛋白、調控Bcl-2 基因表達來減少細胞凋亡，抑制I/R損傷后氧化應激，減輕全身炎性反應，提高心肌對抗I/R的能力，有效保護心肌細胞。

綜上所述，三苦滴丸可以減輕缺血再灌注后大鼠氧化應激，減少細胞凋亡，有效減輕心肌損失。