榅桲總黃酮對心肌梗死大鼠心肌損傷的保護作用及對JNK和NF-κB通路的影響*

孫治霞,索紅亮,王麗輝

(河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院重癥醫學科，鄭州 450002)

急性心肌梗死是心血管疾病死亡的重要原因之一，其發病率和病死率呈逐年上升趨勢[1]。研究表明，急性心肌梗死的發病機制與遺傳、氧化應激、炎癥等心血管疾病危險因素密切相關，多種細胞信號通路在心肌梗死期間和之后發生的病理變化中起重要作用[2]。核因子-κB(NF-κB)作為重要的細胞轉錄因子，是炎性反應和氧化應激反應的關鍵環節。C-Jun N-末端激酶(JNK)信號通路作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號轉導通路之一，參與多種心血管疾病的發病機制。研究證實，從植物中提取的天然黃酮類化合物對急性心肌梗死大鼠心肌損傷具有保護作用[3]。榅桲(Cydonia Oblonga Mill)是薔薇科榅桲屬灌木植物，富含鞣質、有機酸、黃酮等多種藥用化學成分，其中榅桲提取物總黃酮能抗炎、抗氧化、抗血栓，同時還能改善自發性高血壓大鼠的心臟結構和功能[4-5]。但是，榅桲總黃酮對急性心肌梗死大鼠的保護作用及其相關機制尚不明確。本研究通過結扎左冠狀動脈前降支構建心肌梗死大鼠模型，觀察榅桲總黃酮對心肌梗死大鼠的心肌保護作用，并初步探討可能的作用機制，以期為其臨床應用提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 無特殊病原體(SPF)級成年雄性SD大鼠購自北京生命科學研究所，體質量280～320 g，7～8周齡，合格證號：YXK(京)2015-0002。所有實驗程序均經本院倫理委員會批準，并按照國家有關規定進行。

1.1.2原材料及藥品 榅桲葉購自張仲景大藥房，經河南食品藥品檢驗所檢驗為真品。阿托伐他汀鈣片(ACT)購自北京嘉林藥業股份有限公司，國藥準字H20093819，批號201502。

1.1.3主要試劑及儀器設備 水合氯醛購自美國Sigma公司，批號47335；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自英國Abcam公司，批號ab66108；DAPI購自英國Abcam 公司，批號104139；TRIzol購自美國Sigma-Aldrich公司，批號T9424；蛋白濃度測定試劑盒購自美國Solarbio公司，批號PC0030；RIPA裂解液購自碧云天生物技術研究所，批號P0013；大鼠p-細胞外信號調節激酶(ERK，批號sab1306604)、p-JNK(批號sab1305600)、p-p38 MAPK(批號sab4301534)、NF-κB p68(批號HPA023128)、β-actin(批號A1978)、Bax(批號sab2108447)、Bcl-2(批號srp0186)抗體購自Sigma-Aldrich公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號hz-0011c),單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)采用 ELISA試劑盒(批號h-0253c),購自上海滬震實業有限公司。倒置顯微鏡CKX41購自日本Olympus公司；離心機購自無錫瑞江離心機廠；凝膠成像系統購自美國UVP公司；核酸蛋白定量儀K5500購自北京凱奧公司；電泳儀DYCZ-24DN購自北京六一儀器廠；Powerwave XS酶標儀購自中國基因有限公司；酶聯免疫檢測儀購自南京德鐵實驗設備有限公司；CM3050S冷凍切片機購自美國Buffalo Grove公司。

1.2方法

1.2.1榅桲總黃酮的制備 榅桲葉洗凈干燥后粉碎過篩，經石油醚脫脂后真空干燥。將干燥粉末經10倍量75%乙醇超聲提取3次，真空干燥。加水溶解過濾后，洗脫3次，濃縮、干燥后得到總黃酮精制品，測定榅桲總黃酮純度為66.75%。

1.2.2急性心肌梗死大鼠模型制備 根據參考文獻[6]建立急性心肌梗死模型。腹膜內注射戊巴比妥鈉(40～60 mg/kg)使大鼠充分麻醉后，行左胸廓切開術。用6-0無菌絲線距左冠狀動脈前降支根部1～2 mm結扎。當結扎部位下面的左心室顏色由紅色變為白色時，證實結扎成功。假手術組(sham，n=20)不進行冠狀動脈結扎。

1.2.3動物分組及給藥 將冠狀動脈結扎后存活大鼠80只隨機分成4組，每組20只：模型組、阿托伐他汀組(ACT組)、榅桲總黃酮低劑量組(L-COMF)和榅桲總黃酮高劑量組(H-COMF)。術后3 d開始，根據參考文獻[7-8]對各組大鼠進行藥物處理。sham組和模型組灌胃給蒸餾水10 μL/g；ACT組：灌胃給予阿托伐他汀8 mg/kg，給藥劑量按照人與大鼠體表面積法折算等效劑量；L-COMF組：灌胃給予榅桲總黃酮80 μg/g；H-COMF組：灌胃給予榅桲總黃酮160 μg/g。每組大鼠每日灌胃給藥1次，灌胃容積為10 μL/g，連續給藥3周。

1.2.4氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 給藥3周后，各組分別取10只大鼠，取出心臟，冷生理鹽水洗滌后置于-20 ℃過夜。將心臟置于1%氯化三苯硝基四氮唑紅(TTC)中孵育10 min后，經4%多聚甲醛固定24 h，選取周長最長切片使用Image J進行掃描并計算梗死區域面積和缺血危險區面積(AAR)，心肌梗死面積=梗死區面積/缺血危險區面積×100%。

1.2.5血流動力學檢測 給藥3周后，每組各取10只大鼠，經右頸總動脈將導管插入左心室，記錄平均動脈壓(MAP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室內壓上長最大速率(LV+dp/dtmax)、左心室內壓下降最大速率(LV-dp/dtmax)。

1.2.6標本采集 血流動力學檢測完畢后，腹主動脈取血3 mL并迅速取出心臟。將血液置于乙二胺四乙酸(EDTA)管中，輕輕攪動試管并將血液離心30 min后，將血清標本置于-20 ℃保存，待測。心臟經生理鹽水洗滌后，剔除非心肌組織部分吸去水分，一部分取心室周長最大心肌片段，置于10%甲醛緩沖液中固定24 h后，經石蠟包埋待測；一部分取心肌梗死周圍組織，置于-80 ℃保存待測。

1.2.7組織形態學檢測 取石蠟包埋大鼠心肌組織，經切片(5 μm)、烘烤后，經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水合，洗滌后，經蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片后，于顯微鏡下觀察。

1.2.8TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 使用冷凍切片機將冷凍心肌切片(7 μm)，使用TUNEL染色試劑盒對切片進行染色，根據制造商說明書檢測凋亡細胞。心肌細胞用Desmin抗體進行染色標記，細胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。蓋玻片包埋后，通過倒置激光掃描共聚焦顯微鏡于×100倍放大率下進行成像，使用Image J軟件定量TUNEL陽性核的百分比。

1.2.9ELISA檢測TNF-α、MCP-1水平 采用ELISA檢測血清標本中TNF-α和MCP-1水平，所有操作均嚴格按照制造商說明書進行。

1.2.10Western blot分析 取凍存心肌梗死周圍組織，提取總蛋白后，將蛋白質于15%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離并轉移至聚偏二氟乙烯膜上。3%TBST封閉后，與p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK、NF-κB p68、β-actin、Bax、Bcl-2的一抗孵育后，與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育，用增強型化學發光加檢測系統進行檢測。使用圖像分析軟件對條帶進行量化。

2 結 果

2.1榅桲總黃酮對心肌梗死大鼠發揮心肌保護作用 經TTC染色后，正常心肌組織呈藍色，危險區呈磚紅色，壞死區域呈灰白色。模型組大鼠心肌組織可觀察到大片灰白色和磚紅色區域，ACT組、L-COMF組、H-COMF組大鼠心肌組織中灰白色區域和磚紅色區域面積有所降低。見圖1。定量分析顯示，與sham組[(18.65±2.91)%]相比，模型組大鼠心肌梗死面積[(35.82±4.68)%]顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，ACT組[(21.36±4.03)%]、L-COMF組[(26.42±3.22)%]、H-COMF組[(22.18±3.09)%]大鼠心肌梗死面積顯著降低(P<0.05)。

圖1 心肌梗死大鼠心肌組織TTC染色

2.2榅桲總黃酮對心肌梗死大鼠心功能的影響 與sham組相比，模型組大鼠MAP、LVSP顯著降低，LVEDP顯著升高，同時LV+dp/dtmax顯著降低，LV-dp/dtmax顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，ACT組、L-COMF組、H-COMF組大鼠MAP、LVSP顯著升高，LVEDP顯著降低，同時LV+dp/dtmax顯著升高，LV-dp/dtmax顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血流動力學變化

a：P<0.05，與sham組相比；b：P<0.05，與模型組相比

2.3組織形態學檢測 HE染色顯示，sham組大鼠觀察到正常心肌組織結構，心肌細胞形態完整，肌原纖維排列整齊。模型組大鼠觀察到心肌細胞破裂、變性、壞死，心肌纖維排列紊亂、斷裂，并出現炎性細胞浸潤，心肌組織損傷嚴重。ACT組、L-COMF組、H-COMF組大鼠心肌細胞破裂減少，局部散在心肌細胞壞死，肌原纖維排列較整齊，心肌損傷程度減輕。見圖2。

2.4榅桲總黃酮對心肌細胞凋亡的影響 Desmin抗體、TUNEL和DAPI染色共定位證實大多數凋亡細胞為心肌細胞。sham組大鼠TUNEL陽性細胞極少，而模型組大鼠心肌組織中陽性細胞明顯增加，ACT組、L-COMF組、H-COMF組大鼠心肌組織中TUNEL陽性細胞明顯減少(圖3)。定量分析發現，與sham組(每100個細胞0.85±0.06)相比，模型組大鼠TUNEL陽性細胞數(每100個細胞2.11±0.18)顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，ACT組(每100個細胞0.89±0.06)、L-COMF組(每100個細胞1.05±0.08)、H-COMF組(每100個細胞0.91±0.14)大鼠陽性細胞數顯著降低(P<0.05)。

2.5榅桲總黃酮對血清TNF-α和MCP-1水平的影響 與sham組相比，模型組大鼠TNF-α和MCP-1水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，ACT組、L-COMF組、H-COMF組大鼠TNF-α和MCP-1水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.6榅桲總黃酮對心肌組織中NF-κB表達的影響 與sham組(1.01±0.01)相比，模型組大鼠NF-κB蛋白表達(3.26±0.08)顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，ACT組(1.21±0.05)、L-COMF組(2.96±0.06)、H-COMF組(1.25±0.06)大鼠NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖2 各組大鼠心肌組織HE染色結果

圖3 各組大鼠心肌細胞凋亡的變化(×100)

表2 各組大鼠炎癥相關因子MCP-1和TNF-α水平比較

a：P<0.05，與sham組相比；b：P<0.05，與模型組相比

圖4Westernblot分析NF-κB蛋白表達

2.7榅桲總黃酮對心肌組織中MAPKs信號通路的影響 與sham組相比，模型組大鼠p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，ACT組、L-COMF組、和H-COMF組大鼠p-JNK蛋白表達顯著降低(P<0.05)。而L-COMF組和H-COMF組大鼠心肌組織中p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表達與模型組相比差異均無統計學意義(P>0.05)，且明顯高于sham組(P<0.05)。見圖5、表3。

圖5 Western blot分析MAPKs信號通路相關蛋白表達

組別p-ERK1/2p-JNKp-p38 MAPKsham組1.00±0.011.01±0.021.00±0.02模型組2.97±0.09a4.01±0.11a3.02±0.10aACT組1.73±0.08b1.57±0.09b1.18±0.09bL-COMF組2.95±0.09a3.04±0.10b2.99±0.11aH-COMF組2.92±0.08a2.64±0.11b2.97±0.10a

a：P<0.05，與sham組相比；b：P<0.05，與模型組相比

2.8榅桲總黃酮對心肌組織Bax、Bcl-2表達的影響 與sham組相比，模型組大鼠Bax蛋白表達顯著增加，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，ACT組、L-COMF組、H-COMF組大鼠Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著增加(P<0.05)。見圖6、表4。

組別BaxBcl-2sham組 1.01±0.011.00±0.01模型組3.85±0.10a0.21±0.04aACT組1.07±0.09b0.98±0.05bL-COMF組3.16±0.11b0.40±0.04bH-COMF組2.33±0.08b0.76±0.04b

a：P<0.05，與sham組相比；b：P<0.05，與模型組相比

3 討 論

本研究通過結扎左冠狀動脈前降支構建急性心肌梗死模型，并用組織學檢測觀察到心肌梗死大鼠心肌細胞破裂、變性、壞死，心肌纖維排列紊亂、斷裂，出現炎性細胞浸潤。同時，TUNEL檢測觀察到心肌細胞凋亡，提示建模成功。心肌缺血過程中心臟炎性反應的直接后果是引起心肌細胞凋亡，心肌細胞凋亡能夠導致心功能受損，是引起左心室重構和心力衰竭的重要因素之一[9]。本研究發現模型組大鼠MAP、LVSP顯著降低，LVEDP顯著升高，同時LV+dp/dtmax顯著降低，LV-dp/dtmax顯著升高，提示心肌梗死大鼠心肌舒縮功能受損和血流動力學異常。心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡、壞死，引起梗死區嚴重炎性反應，心肌炎性反應進一步加劇心肌細胞凋亡，最終引起心功能失調。同時本研究還發現，榅桲總黃酮治療能夠降低心肌梗死大鼠危險區和壞死心肌面積，對心肌梗死大鼠有心肌保護作用，可能是由于榅桲總黃酮能夠緩解心臟過度收縮并降低心室舒張壓，改善心臟收縮功能，恢復缺血引起的心臟結構改變，從而改善心肌梗死大鼠心功能。 上述結果均表明榅桲總黃酮能夠顯著改善心肌梗死大鼠炎性反應、心肌細胞凋亡和心功能，從而發揮心肌損傷保護作用，然而具體作用機制尚不明確。

MCP-1作為主要的趨化因子，能夠募集和活化心肌組織中的炎性細胞到達炎性反應部位，從而引發和維持炎性反應，在動脈粥樣硬化、心肌梗死、心室重構等心血管疾病中起重要作用[10-11]。TNF-α作為一種重要的炎性因子，在衰竭心肌中大量表達，與臨床血流動力學嚴重程度密切相關。研究表明，心力衰竭組織中TNF-α高表達能夠引起心肌細胞凋亡、心肌肥大和心室重構[12]。而NF-κB對炎性因子和趨化因子起重要調控作用，NF-κB是真核生物中廣泛存在的特異性DNA結合蛋白，具有多向轉錄調控作用，在調控心肌缺血引起的炎性反應中起重要作用[13]。炎性因子能夠激活NF-κB，使NF-κB從細胞質中快速轉移至細胞核，同時NF-κB的激活能夠進一步誘導包括炎性因子和趨化因子在內的多種靶基因表達，導致細胞凋亡和組織損傷，從而參與包括冠心病和急性心肌梗死在內的多種病理生理過程[14-15]。本研究發現，模型組大鼠TNF-α和MCP-1水平均顯著升高，同時NF-κB蛋白表達顯著升高，表明心肌梗死后心肌損傷與機體炎性反應有關；經榅桲總黃酮治療后，TNF-α和MCP-1水平顯著降低，同時心肌組織中NF-κB蛋白表達顯著降低。結合過往研究推測，榅桲總黃酮可能通過降低心肌梗死后炎癥相關因子的表達，從而抑制NF-κB活化，而NF-κB活性的抑制又進一步降低炎性因子和趨化因子的表達。

MAPKs信號途徑作為細胞內重要的信號轉導通路，能夠被炎性介質激活，而激活的MAPKs能夠連接并激活不同的目標激酶，參與多種級聯反應調節，從而參與調控多種生理和病理過程。MAPK信號轉導途徑可作用于下游底物NF-κB，促進促炎基因的轉錄。已證實，在哺乳類動物細胞中存在3條并行的MAPK信號通路：p38 MAPK、細胞外信號調節激酶(ERK)和JNK，MAPK上特定氨基酸序列磷酸化可將3條通路全部激活，且它們在調控細胞功能時不僅能獨自發揮作用，而且能相互交錯[16]，且與多種心血管疾病均密切相關[17-18]。本研究發現，心肌梗死大鼠心肌組織中ERK1/2、JNK、p38 MAPK磷酸化水平升高，提示MAPKs信號通路活化。經榅桲總黃酮治療后，心肌梗死大鼠心肌組織中JNK磷酸化水平顯著，而ERK1/2、p38 MAPK磷酸化水平未發生明顯變化，提示榅桲總黃酮能夠阻止心肌梗死引起的JNK信號通路活化，而對ERK1/2、p38 MAPK信號通路無明顯影響。研究發現，JNK能夠被TNF-α等炎性細胞因子激活，參與調控心肌細胞凋亡和炎性反應，在心肌損傷中發揮重要作用[19]。該研究還顯示，心肌梗死大鼠JNK的活化能夠激活NF-κB，使其從細胞質易位至細胞核，從而引起炎性損傷和細胞凋亡。結合過往研究推測，榅桲總黃酮能夠通過調控JNK信號通路，降低炎性反應和心肌細胞凋亡，改善心肌梗死大鼠心肌功能。

還有研究證實，心肌梗死后心肌細胞凋亡能夠導致左心室重構，是引起心力衰竭發生的重要機制，而持續而強烈的炎性反應是引起心肌細胞凋亡的重要原因[20]。JNK的激活通過調控凋亡相關Bcl-2家族蛋白活性，從而誘導細胞凋亡[21]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族最重要的細胞凋亡相關基因，二者結合通過形成異構二聚體或共同調節胞內Ca2+濃度從而發揮抗凋亡作用[22-23]。本研究發現，模型組大鼠Bax蛋白表達顯著增加，Bcl-2蛋白表達顯著降低，證實心肌梗死后心肌細胞凋亡，而經榅桲總黃酮治療后，Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著增加，提示榅桲總黃酮能夠通過調控Bcl-2蛋白家族，降低心肌梗死引起的心肌細胞凋亡，發揮心肌保護作用。

綜上所述，榅桲總黃酮能夠對心肌梗死大鼠心肌損傷發揮保護作用，這可能是通過抑制JNK和NF-κB信號通路，從而下調心肌梗死引起的炎癥損傷和細胞凋亡來實現的。然而心肌梗死引起心肌損傷的過程極其復雜，所涉及信號通路及蛋白還需進行深入探究，以期為疾病的治療提供更充分的理論依據。