馬齒莧提取液對急性濕疹大鼠皮膚屏障功能的調控作用*

胡一梅，葛一漫，雍江堰，王 毅

(1.成都中醫藥大學臨床醫學院，成都 610037;2.成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610075；3.成都中醫藥大學醫學技術學院，成都 610037)

急性濕疹是臨床上常見的炎性皮膚疾病，該病發病機制復雜，目前與皮膚屏障功能障礙相關的研究為主要方向之一[1-2]。皮膚屏障發揮正常的防御功能，以及保持表皮水分和電解質作用需要依靠角質層的完整，即“磚-墻結構”的完整。角質細胞作為“磚頭”構成支架結構，細胞間脂質作為“泥漿”用來黏合穩固“磚頭”。以上任一結構發生變化可能導致皮膚屏障異常，從而誘發急性濕疹。

本實驗擬通過運用馬齒莧提取液對急性濕疹大鼠模型進行干預治療，結合局部皮損處經皮水分丟失量(transepidermal water loss，TEWL)、蛋白酶激活受體2(protease activated receptor-2，PAR-2)及人類中間絲聚合蛋白(filaggrin，FLG)的表達，探討馬齒莧對皮膚屏障的調控作用及其在急性濕疹發生發展中起到的主要作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 體質量180～220 g的清潔級大鼠[成都達碩生物科技有限公司，許可證號:SCXK(111)2008-24]30只，雌雄不限。

1.1.2藥物與試劑 馬齒莧提取液(去根的新鮮馬齒莧鮮榨提取獲得)。二硝基氯苯(dinitrochlorobenzene，DNCB；成都科龍化工試劑廠，批號：20090813)。

1.1.3儀器 AF200皮膚表皮水分喪失測定儀( 英國BIOX公司)；反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增儀(美國ThermoFisher儀器有限公司)；Image-Pro Plus6.0病理圖像分析系統(福建省麥克奧迪實業集團有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組及造模 實驗第1天首次致敏于大鼠腹部皮膚涂抹5% DNCB 30 μL，2 d后進行2次激發，在大鼠右背部皮膚涂抹0.2% DNCB 50 μL，連續攻擊3次，每3天1次。第9天將20只造模大鼠平均分為模型組和馬齒莧組。另有不作處理的10只大鼠為正常組。第10天馬齒莧組大鼠給予馬齒莧藥物進行治療，連續9 d。

1.2.2實驗取材 末次給藥后，斷頸處死大鼠，取大鼠皮損組織2塊，一塊固定于10%中性甲醛中48 h；另一塊置于-80 ℃液氮中速凍，待測。

1.2.3觀察指標 (1)表皮TEWL值測定：采用皮膚表皮水分喪失測定儀測定各組大鼠TEWL值。(2)各組大鼠皮膚PAR-2及其水平的測定：將上述各組大鼠右背部皮膚包埋的蠟塊切成4 μm厚的組織切片，按照免疫組織化學試劑盒說明書進行PAR-2免疫組織化學染色，同時設置陽性和陰性對照。一抗PAR-2購自北京博奧森生物技術有限公司，克隆號：bs-1178R。二抗及相應試劑盒及陽性片購自北京中山金橋生物有限公司。染色后封片，顯微鏡下觀察，圖像分析系統計算PAR-2的積分光密度。(3)RT-PCR檢測大鼠皮膚FLG基因的表達：用Trizol法提取急性濕疹大鼠皮膚組織中的總RNA，并鑒定檢測樣品純度。根據RT-PCR試劑盒說明書進行操作，使用System SDS Software軟件計算循環閾值(Cycle threshold，Ct)，采用β-actin作為內參照基因，以2-△△Ct作為Filaggrin基因的表達水平。Filaggrin引物序列，上游5′-AGG AGC GAG ACC ATC AGC-3′；下游5′-GCA CCT TGC CAC TCT GTT-3′。β-actin引物序列，上游5′-TCT AGG CAC GTG GCA AGG GTG TG-3′；下游5′-TCA TGA GGT AGT TGC CGT CAG G-3′。

2 結 果

2.1各組大鼠大體外觀比較 正常組大鼠皮膚光滑無異常，模型組大鼠右背部造模區皮膚出現肉眼可見紅腫、丘疹、水皰、糜爛和滲出等急性濕疹癥狀。馬齒莧組大鼠用藥后，造模區皮膚紅腫、糜爛和滲出等皮損程度降低，丘疹和水皰消散，皮膚變得光滑。見圖1。

圖1 各組大鼠皮膚臨床表現

2.2各組TEWL的檢測結果 用藥后，正常組大鼠TEWL水平為(2.35±0.18)g·h-1·m-2，模型組為(11.36±1.66)g·h-1·m-2，馬齒莧組為(3.25±0.47)g·h-1·m-2，與模型組比，馬齒莧組大鼠TEWL水平顯著降低(P<0.05)，但高于正常組(P<0.05)。

2.3各組大鼠皮膚組織PAR-2檢測結果 鏡下可見PAR-2陽性物質呈棕黃色、黃色、淺黃色顆粒狀，位于皮膚表皮棘細胞、皮膚附屬器汗腺細胞、皮脂腺細胞、毛囊細胞、真皮內炎細胞胞漿，部分位于真皮內間質組織中。用藥后，馬齒莧組PAR-2陽性物質染色變淺、分布面積減少(圖2)。用藥后，正常組大鼠PAR-2水平為(0.153 4±0.002 2)μm2，模型組為(0.170 8±0.011 5)μm2，馬齒莧組為(0.154 1±0.006 8)μm2，與模型組相比，馬齒莧組PAR-2水平明顯降低(P<0.05)，但略高于正常組(P>0.05)。

2.4各組大鼠皮膚FLG的檢測結果 正常組大鼠FLG基因表達為(6.20±0.68)，模型組為(0.79±0.19)，馬齒莧組為(4.34±1.21)。與模型組比，馬齒莧組大鼠FLG基因的表達顯著增高(P<0.05)，但低于正常組(P<0.05)。

圖2 各組大鼠皮膚組織中PAR-2的表達(免疫組織化學染色×200)

3 討 論

外界過敏性物質對皮膚屏障的破壞是急性濕疹疾病發生、發展的誘因之一。由于皮膚屏障功能的異常表達，使過敏原從外環境滲透到皮膚，導致急性濕疹發生并進一步惡化[3]。馬齒莧主要含有生物堿類、萜類、香豆素類、黃酮類、有機酸類、揮發油及多糖等化學成分，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力的作用，在臨床上主要用于治療濕疹、炎癥、瘙癢癥和糖尿病等疾病[4]。作者的前期研究發現，馬齒莧能夠明顯改善DNCB所致的大鼠急性濕疹癥狀[5-6]。

研究發現，皮膚屏障功能的優劣與代表角質層水分流失量的TEWL呈負相關關系，TEWL越高，表示角質層含水量越少，皮膚屏障功能損傷越嚴重[7]。本實驗結果發現，急性濕疹大鼠TEWL明顯增高，這與SIMPSON等[8]研究結果一致，馬齒莧組TEWL比模型組顯著降低。結果提示，馬齒莧可能是通過減少TEWL，增加角質層水分含量，修復受損的皮膚屏障，達到治療急性濕疹的作用。

急性濕疹發生時，皮膚代謝功能異常，使得皮膚抗炎因子和脂質減少，皮膚出現炎性反應，皮膚表面pH值升高，增加了激肽釋放酶(kallikrein，KLKs)的活性，KLKs可進一步激活PAR-2，活化的PAR-2可使板層小體掩埋在角質細胞內難以釋放，抑制其正常分泌，引起細胞間脂質水平的減少，破壞皮膚屏障功能[9-10]。激活的PAR-2還可引起炎性因子的過表達，加重皮膚組織的炎癥損傷程度，進一步破壞皮膚屏障，形成惡性循環[11]。本實驗結果發現，馬齒莧組PAR-2水平比模型組顯著降低。提示，馬齒莧可通過降低PAR-2水平，減少TWEL，恢復皮膚屏障中“泥漿”的功能，緩解急性濕疹癥狀。

皮膚屏障的完整性是預防和治療急性濕疹的前提，皮膚屏障形成的主要物質之一是FLG。若FLG基因發生無義突變，可導致絲聚合蛋白原失去活性，減少FLG的產生，破壞角質細胞“磚塊”結構的支架作用[12]。本實驗結果發現，急性濕疹大鼠FLG基因呈低表達，這與RIETHMULLER等[13]研究結果一致，馬齒莧組FLG基因表達比模型組明顯增加，提示馬齒莧通過增加FLG基因表達，增加FLG水平，恢復角質細胞“磚塊”結構的支架作用，從而降低TWEL，恢復皮膚屏障功能，達到治療急性濕疹的目的。

FLG基因的無義突變使FLG減少或缺失，這可引起天然保濕因子減少，導致皮膚表面偏堿性。表皮pH值的改變可激活PAR-2，降低表皮脂質的水平，增加TWEL，破壞皮膚屏障功能。本實驗發現，用藥后，馬齒莧組中PAR-2表達較模型組降低，FLG基因表達增加，提示作為急性濕疹的治療靶點，不僅PAR-2的活性改變會影響治療效果，其水平的改變也可能影響療效。

綜上所述，馬齒莧可能是通過增加FLG基因表達，降低PAR-2水平，減少TEWL，恢復皮膚屏障功能，從而發揮治療急性濕疹的作用。馬齒莧是否還可能是通過增加FLG基因的表達來抑制PAR-2的活性，達到恢復皮膚屏障功能治療急性濕疹的作用，有待進一步研究。